高压液相色谱法同时测定食品中维生素A、维生素D、维生素E和维生素K

出处：按学科分类—工业技术 中国轻工业出版社《食品添加剂分析检验手册》第245页（1791字）

1．试剂和溶液

1．1 95%乙醇 分析纯。

1．2 乙醚 分析纯。

1．3 焦性没食子酸 分析纯。

1．4 无水硫酸钠 分析纯。

1．5 丙酮 分析纯。

1．6 脂肪酶 粗制剂。

1．7 pH6．8磷酸缓冲液 0．2mol／LKH₂PO₄溶液50mL与0．2mol／LNaOH溶液23．69mL混和。

1．8 50%KOH 称50g分析纯KOH，溶于100mL水中。

1．9 维生素A醋酸盐标准液(特级，1000000IU／g) 称取50mg标准，用异丙醇定容至25mL，制成2000IU／mL的贮备液，再以标准贮备液制成100IU／mL的标准添加液，和10mLIU／mL的标准HPLC外标液。

1．10 维生素D标准(MERCK) 称取5．3mg标准，用少量乙醇溶解后用甲醇定容至50mL，即为106μg／mL的标准液。再取1mL定容至25mL即为4．24μg／mL的HPLC外标液。

1．11 维生素E标准(DL-α-Tocopherol一级品) 称取57．4mg标准，用异丙醇定容至50mL，即为1148μg／mL的标准贮备液。再稀释为11．48μg／mL的HPLC外标液。

1．12 维生素K标准(MERCK) 称取13．8mg标准，用甲醇∶乙酸乙酯(43∶7)溶解并定容至50mL，即为0．276mg／mL的标准贮备液，再稀释为11．04μg／mL的HPLC外标液。

2．仪器

2．1 高压液相色谱仪(C₁₈粒，紫外检测器)。

2．2 直型K-D浓缩器。

2．3 磁力加热搅拌器。

3．样品制备及测定

3．1 皂化法同时测定维生素A、维生素D和维生素E 称取5～10g样品，加1g焦性没食子酸，再加入70mL95%乙醇，在磁力搅拌下使样品均匀溶解后，加入30ml50%KOH溶液。在(50±2)℃下搅拌回流40min。取下冲凉后用50mL，30mL，20mL，20mL乙醚萃取，合并乙醚层，用水洗至中性，过无水硫酸钠，在波长50℃下浓缩至约5mL取下后，用甲醇定容至10mL，进HPLC分析。进样量5～20μL。在265nm下测定维生素D，在波长290nm下测定维生素A、维生素E。按峰面积计算样品中的维生素A、维生素D、维生素E含量。流动相甲醇流速为0．8mL／min。

3．2 酶解法同时测定维生素A、维生素D、维生素E和维生素K 称取5～20g样品，加脂肪酶0．5～1．0g(视样品中的脂肪含量而定)，加pH6．8磷酸缓冲液50mμ，在磁力搅拌下，于(38±2)℃保湿0．5～4h，取下放冷后，以30mL，20mL，20mL丙酮萃取，合并丙酮层，用40mL，30mL，20mL乙醚萃取，乙醚层以5%氯化钠水溶液洗，乙醚层过无水硫酸钠，然后在K-D浓缩器上浓缩至5mL，定容至10mL，进HPLC定量测定。进10～25μL，在265nm下测维生素D、维生素K，在波长290nm下测维生素A、维生素E。以峰面积进行计算。流动相甲醇流速2．0mL(265nm)，0．8mL(290nm)。

4．分析结果的表述