中和试验

出处：按学科分类—农业科学中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第196页（5328字）

有生物活性的抗原与相应抗体结合后，可使其失去原有的生物活性，谓之中和反应。此种中和反应不仅有高度特异性，且具有严格的量的关系。因此可用中和试验以鉴定活性抗原，也可用于相应抗体的定量。主要包括病毒中和试验、毒素中和试验和某些致病酶的中和试验，后者本质上也是一种毒素。

一、毒素中和试验

某些致病菌，如白喉杆菌，破伤风梭菌和肉毒梭菌等，都能产生强烈的外毒素。此外如链球菌的溶血毒素、魏氏梭菌、肠致病大肠杆菌和霍乱弧菌的肠毒素等也都是外毒素，此类毒素都是蛋白质，具有良好的免疫原性，能刺激动物产生具有中和活性的抗毒素。

毒素中和反应机理视抗毒素的性质和作用部位而异。主要有以下二种方式。

1．抗毒素与毒素结合后，直接掩蔽毒素的活性部位，使其失去活性。

2．抗毒素与毒素结合能干扰毒素与细胞受体结合，阻止毒素的活性部分进入细胞。

毒素中和试验有体外法和体内法二种，视反应的性质和试验要求不同，而有很多形式。

(一)体内中和试验

1．毒素单位滴定以1单位(AU)标准抗毒素，或AU／1000抗毒素与不同量的毒素体外混合后，置37℃1～3小时，分别接种规定的实验动物，记录在指定时间内的死亡数和存活数。使实验动物全部存活的最大毒素量称为无毒限量(Lo)或1／1000无毒限量(Lo／1000)，中和后仍能使动物全部死亡的最小毒素量称为致死限量(L+)，或1／1000死亡限量(L+／1000)。

有的毒素皮内注射后能引起皮肤红斑，则可用皮内法接种实验动物，能产生皮肤反应的最小毒素量称为皮肤反应限量(Lr)或1／1000皮肤反应限量(Lr／1000)。

2．抗毒素单位滴定标准毒素不稳定，不易保存，而标准抗毒素十分稳定，故测定抗毒素单位时，必须先用标准抗毒素测定毒素的L+或L+／1000，然后再将待检抗毒素血清10倍递进稀释加入等量的L+或L+／1000的毒素，室温1～3h，接种实验动物，使动物全死或全部存活之间的稀释度倒数，即该血清的终点(AU／ml)。

3．用毒素中和试验滴定破伤风抗毒素，需先用标准抗毒素测定所试破伤风毒素的L+／1000毒素剂量。(1个L+／1000剂量为与1／1000AU的抗毒素混和后，注射0．5ml于小白鼠皮下，能在96小时致死小白鼠的最小毒素量。)然后再滴定抗毒素单位，操作程序如下。

(1)将标准抗毒素用含0．2%明胶的PBS(0．067Mol／ml，pH7．4)稀释成0．004Au／ml，与系列稀释的破伤风抗毒素等量混合，共8～10管，轻轻振摇后，置37℃作用1h，放于4～，8℃直至注射。

(2)取体重15～18g小白鼠，每只皮下注射上述混合物0．5ml。每一稀释度用4～10只小白鼠，每一剂量抗毒素含量为1／1000Au。

(3)观察96h，能全部致死小白鼠的最小毒素量，即为L+／1000剂量。

(4)需滴定抗毒素的血清：置56℃水浴灭活30min。

(5)在一列试管中作1×、10×、100×、1000×、10000×稀释，加入等量每ml1个L+／1000剂量的毒素，每鼠接种混合物0．5ml，每头剂含毒素L+／4000，观察96h，分析结果。

结果举例：如10×稀释全保护，而100×稀释血清全死，则0．25ml的10×稀释血清中含抗毒素量＞0．00025AU，0．25ml的100×血清含抗毒素＜0．00025AU，故该血清含抗毒素量应为＞0．01而＜0．1AU／ml，如以对数中点计算，则该血清所含抗毒素量为0．03AU／ml。

4．魏氏梭菌肠毒素分型魏氏梭菌常见有A、B、C、D四种毒素型，根据其抗原组成的关系，可以用B、C、D三种抗毒素进行分型鉴定。

(1)先测定待检肠毒素对小白鼠的最小致死量(MLD)，然后将其稀释成20MLD／ml。

(2)取灭菌试管4支，各加入上述毒素1ml，第1～3管分别加入B、C、D型抗毒素1ml，第4管加生理盐水1ml，置37℃作用40min。

(3)每组各静脉注射小白鼠2只，每只0．2ml，观察24h，第4组小白鼠均应死亡，其他各组结果，按下表作出判断。

表9-14 魏氏梭菌肠毒素定型中和试验

注：+示动物存活，中和试验阳性。一示动物死亡，中和试验阴性。

(二)体外中和试验

1．细胞培养方法白喉毒素在HeLa细胞上，能阻止细胞蛋白合成，引起细胞病变，因此可在细胞培养上进行毒素中和试验，方法同病毒中和试验。

2．溶血毒素中和试验一部分键球菌能产生溶血毒素，其中包括溶血素O和S，多数A群链菌球可同时生产二种溶血毒素。测定血清中抗溶血素O抗体试验是将待检血清倍比稀释，加定量的溶血素O，37℃作用30分钟后，加入红细胞悬液。观察结果，能抑制红细胞溶解的血清最大稀释倍数，即该血清的抗键链球菌溶素O的效价。

3．Ramon絮状反应主要用于测定毒素或类毒素的絮状反应限量(Lf)，当毒素或类毒素为已知时，亦可用于测定抗毒素单位，将已知单位的抗毒素倍比稀释，加等量的待检毒素或类毒素，混合后，置37℃水浴，不时观察沉淀反应的出现，反应出现最快，沉淀物最多的一管为抗原抗体结合的最适比。

例如：抗毒素4×与毒素160×的一管出现反应最早，则所测毒素与抗毒素的最适比为1／160∶1／4=1∶40。能与1单位抗毒素结合的最适毒素量即为1个Lf单位，如已知抗毒素含量为0．25单位／ml，则所测毒素的Lf含量可按下式计算：

4．诺维氏梭菌的卵磷脂酶试验用病死动物的腹水或肝坏死病灶的1∶5，1∶10组织悬液，离心沉淀后，取上清液供试，取4支试管，每管加上述试液0．5ml，再于第1～3管分别加入A型、B型和魏氏梭菌A型抗毒素血清各0．25ml，第4管加生理盐水作为对照，混匀后，置室温30min，每管加入卵磷脂卵黄磷蛋白0．25ml，混合后置室温1～2h，观察结果，若对照管中出现乳光层，表明被检材料中含有卵磷脂酶。在1～3管中，此反应被何种抗毒素所抑制(不出现乳光层)，即该明此卵磷脂酶为该菌细菌所产生，如第2管反应被抑制，即证明被检材料中含有B型诺维氏梭菌所产生的卵磷脂酶，该动物死于羊黑疫。

二、病毒中和试验

中和抗体与病毒结合后，可使其感染性降低或消失，但抗体只能在细胞外中和病毒，对已进入细胞的病毒，则无能为力。

抗体的中和作用主要是阻止病毒与细胞上的病毒受体结合，阻止病毒吸附。某些病毒，如痘病毒，被抗体包被后，可被吞饮进入细胞，在吞饮泡内使病毒不能脱壳，即使脱壳，其核酸很易被泡内的溶酶体酶所分解，而不能正常复制，有囊膜的病毒在抗体补体的作用下，可使囊膜裂解而失去感染性，病毒粒子的凝聚也可使其感染性降低。

并不是所有能与病毒结合的抗体都有中和活性，如马传贫的补体结合抗体和沉淀抗体，病毒与抗体结合后，仍保持高度感染力，流感病毒和新城病毒的抗血凝集抗体能阻止病毒吸附，具有高度中和活性；而抗神经胺酸抗体则无此活性。

中和试验具有高度特异性和敏感性，不仅可用于病毒的鉴定与定型，还可用于测定抗体的中和活性，并为研究病毒保护性抗原的重要手段。

(一)毒价滴定中和试验是以能中和一定量病毒的感染力为基础的，因此，必须先测定病毒的感染力，进行毒价滴定。滴定时，需先根据病毒的致病特性选择适合的细胞，鸡胚或实验动物，然后将病毒原液作10倍递进稀释，选择4～6个稀释度接种细胞培养(或鸡胚、实验动物)，每组3～6管(只)，接种后观察细胞病变(或发病死亡)，最后按Reed和Muench法或Körber法计算TCID₅₀(或ELD₅₀，LD₅₀)，Körber法较为简易，举例说明于下。

表9-15 病毒TCID₅₀滴定