李氏杆菌属

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第413页（4514字）

李氏杆菌属亦称李斯特氏杆菌属，系革兰氏阳性的短杆菌，大小为0．4～0．5μm×0．5～2μm，无荚膜，无芽孢，培养在20～25℃时有运动性，为数不多的鞭位于周身，非抗酸性，需氧并兼性厌氧，营养琼脂上24～48h的菌落为圆形、隆起、边缘整齐、透明，直径为0．5～1．5mm的露珠状菌落，最适生长温度为30～37℃，生长温度范围为1～45℃，故对送检材料可置冰箱(4℃)冷增菌10天左右(最长30天)以易于分离此菌。最适生长pH为7．2左右，可生长pH为6～9。接触酶阳性，氧化酶阴性，发酵葡萄糖等产酸，M．R．阳性，V．P．阳性，不利用柠檬酸盐，不产生吲哚，不水解尿素，但水解七叶苷(亦称七叶灵或马栗苷)及马尿酸钠，广泛地存在于自然界，如水、污泥、下水道、人畜粪便、草木生长处等，有的是人、畜病原菌，余见表18-1及表18-2。表12-2列举了本属的八个种的区别，即单核球增多症李氏杆菌(L．monocytogengenes)、无害李氏杆菌(L．innosus)、西氏李氏杆菌(L．seeligeri)、韦氏李氏杆菌(L．welshimeri)、伊氏李氏杆菌(L．ivanovii)、格氏李氏杆菌(L．grayi)、麦氏李氏杆菌(L．murrayi)及脱氮李氏杆菌(L．denitrificans)。

伊氏李氏杆菌是近年来从孕羊病理材料中分得的细菌，腹腔注射到小白鼠可引起发病或致死，此菌引起绵羊流产的危害性怎样，有待作更多的观察，但远不如布氏杆菌、胎儿弯杆菌等重要，故本属细菌中只对本属的重要病原菌——单核球增多症李氏杆菌予以叙述。

表18-2 李氏杆菌属八个种的区别

符号说明：+表示90%以上阳性；一表示90%以上阴性；d表示11～89%阳性；空白表示资料暂缺；?表示未定。

单核球增多症李氏杆菌至少感染37种哺乳动物和17种鸟类，有自然疫源性，是人、绵羊、山羊、牛、马、猪和其他动物脑膜脑炎、流产、败血症等的病因。根据Paterson氏认为本菌有4个血清型，第1型主要感染啮齿动物，第4型主要感染反刍动物。各型均可感染人，但以第1型为多见。

1．样品采集 根据不同病例而采样，采样时注意无菌操作，并避免自身感染。

(1)脑炎病例 取脑脊液和脑组织，或将死亡动物的头送往诊断室。

(2)流产病例 取子宫、阴道分泌物，流产胎儿的肝、脾、肺。

(3)败血症病例 取血液送检。

2．检验程序和方法

(1)形态学检查

①自脑干或颈部脊髓前部(颈索)作组织压印片，甲醇固定，或取脑脊液3000r／min离心沉淀后，去上清(留0．5ml)，取沉淀物作抹片，加热固定，革兰氏染色。镜检在细胞内外可见革兰氏阳性小杆菌或球杆菌。幼龄培养物抹片，常呈栅栏状排列及V或Y字形构形。人工培养物染色镜检，粗糙型菌可形成短链或丝状。本菌无芽孢、一般不产生荚膜，有鞭毛，能作滚转运动。

也可用荧光标记抗体(1，4型)染色镜检。

②用阴道拭子作抹片，或用流产胎儿肝、脾、肺等组织剖面作抹片，甲醇固定(3～5min)，革兰氏染色镜检。

(2)分离培养 所有送检病料均应分成两份，一份用于直接分离培养，另一份4℃保存(实质器官可先行剪碎，加适量肉汤、匀浆后保存)，行冷增菌(李氏杆菌在3～45℃均能生长，其他杂菌低温状态下生长即停止)后，每周作分离培养1次。

①取脑脊液或子宫阴道分泌物和流产胎儿脑、肝、脾组织或病畜脑组织匀浆液。划线接种于血液(羊或兔)琼脂平板上(本菌在血琼脂上生长，产生β型溶血环)，在10%CO₂环境中，于35℃孵育18～24h。

②污染病料可接种于胰胨肉汤中，48h后再接种血琼脂平板，或划线接种于含亚碲酸钾琼脂或TNA平板上(本菌对碲酸盐具有相当抵抗力，在培养剂中加入碲剂能抑制杂菌生长。取病料乳剂0．1，0．2，0．25ml，分别接种于小白鼠腹腔内，常在接种后3～10日内死亡，取死鼠肝、脾、心血作分离培养。

上述平板在35℃孵育，观察至少二周。如有李氏杆菌生长则在血琼脂上出现圆形、光滑、半透明、β型溶血菌落；在含碲酸盐琼脂上出现黑色、TNA琼脂上出现蓝绿色(45℃折光观察)菌落，挑取疑似菌落进一步纯化。

③当疑似败血症时，取血液5ml加于50ml的液体培养基(脑、心浸液或胰胨肉汤)内，35℃孵育，每周作次代培养。

④用冷增菌病料，每周作分离培养，直到3个月，虽确能增加分离率，但需时过久，从诊断观点来看，是不切合实际的。

本菌在普通培养基上能够生长，但在含葡萄糖、血液、血清、腹水培养基上生长更好。光滑型菌形成细小、透明、现虹彩色、露滴状菌落，45℃折光出现特征性蓝绿色。在液培养基中生长，均匀一致浑浊，几天后于管底形成絮状沉淀。粗糙型菌形成较大而扁平菌落，中央疣状有喷火口状中心，边缘不整齐。在液体培养基中生长，呈絮状混浊，表面有菌膜，底部有颗粒状沉淀。

(3)生化检验 发酵多种糖类产酸不产气。鉴于本菌和猪丹毒杆菌有些方面相似(如菌落形态、生长需求、DNA的G+C容量等)，为避免混淆，兹将二菌的区别要点列于表18-3。

表18-3 李氏杆菌和猪丹毒杆菌区别表

说明：+表示发酵产酸或阳性；一表示不发酵或阴性；d表示变化不定；(d)表示某些菌株3～7天产酸，有些则为阴性。

(4)动物试验

①点眼反应(Anton氏试验)取本菌24h纯培养物一滴，滴入兔结膜囊内，另一侧留作对照。一般在24时内出现化脓性结膜、角膜炎，眼炎虽可自愈，但视觉可能丧失，兔罕见死亡(注意：猪丹毒杆菌也能产生类似反应，故对反应结果要作综合分析)。

②致病性试验

家兔：取每ml含菌约3亿菌液0．5ml，注射于幼兔耳静脉内，3～7日内兔体温升高，血液中单核细胞增多(40%以上)，大剂量接种，出现脑炎症状，可能在7日内死亡。剖检可见肝脏有多发性灶性坏死，偶见心肌脓肿和脑膜炎症。腹腔接种后，可引起浆液、纤维素性、脓性腹膜炎、孕兔并发子宫内膜炎及流产。

小白鼠：皮下或腹腔接种10⁸强毒菌，可在1～4天死亡。病鼠出现结膜炎，剖检可见肝脏遍布多灶性坏死，从脾脏和心血易分离得纯菌。Ralovich氏等(1972)报道β-溶血菌株对小白鼠LD₅₀值为10⁶～10⁷，不溶血菌株LD₅₀值约1．5×10⁹。

(5)血清学检验根据本菌菌体和鞭毛抗原不同，可分为1、2、3、4等4个血清型。鉴于几乎所有正常人和反刍兽血清中都有李氏杆菌抗体，且本菌与肠球菌、埃希氏大肠杆菌、一些具有运动能力的棒状杆菌及许多革兰氏阳性菌之间能产生交叉反应，因此，血清学诊断对一般诊断室是没有实用意义的。

有关培养基的制法如下。

胰胨肉汤(Tryptose broth)培养基可将胰胨2g、氯化钠0．5g、葡萄糖0．1g溶于100ml蒸馏水中，调pH至7．2，15磅高压15min。如含有琼脂2g则为胰胨琼脂，加5%鲜血则为胰胨血琼脂。可供李氏杆菌、布氏杆菌、链球菌、巴氏杆菌等分离培养用。

亚碲酸钾琼脂(Potassium tellurite)琼脂做法如下。

1．成分

3%琼脂培养基(pH7．6) 100ml

1%亚碲酸钾水溶液 2ml

0．5%胱氨酸水溶液 2ml

脱纤绵羊血或兔血 5～10ml

2．制法 取融化的3%琼脂培养基(pH7．6)100ml，待冷至40～50℃时，以无菌操作加入灭菌的亚碲酸钾溶液、胱氨酸溶液(二者应分别滤过灭菌或间歇灭菌)及脱纤血液，摇匀后倾注平皿备用。

3．原理 亚碲酸钾能抑制大部分杂菌生长，李氏杆菌能还原亚碲酸钾出现黑色菌落，胱氨酸有促进李氏杆菌生长之效。

TNA琼脂(Trypaflavine-Nalidixic-Agar，锥虫黄—萘啶酸琼脂)做法如下。

1．成分

胰胨琼脂(tryptose agar) 41．05g

萘啶酸 0．04g

蒸馏水 1000ml

锥虫黄 25 μg／ml

2．制法 将琼脂高压灭菌、融化并凉至70℃，再把锥黄素溶于蒸馏水中，按25μg／ml剂量加入琼脂培养基内，摇匀后倾注平皿备用。

3．李氏杆菌在TNA培养基上的菌落呈亮绿到蓝绿色。