聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《农作物品种鉴定手册》第116页（13792字）
根据H．Stegemann和我们的研究认为，垂直板电泳比圆柱电泳具有凝胶网状结构均匀一致，需样品数量少，灵敏度高，操作方便，所需胶液量少，节约成本，便于品种间电泳图谱比较鉴定等特点。所以，一般品种鉴定和纯度测定，以采用垂直板电泳为宜。
1．仪器和试剂 所用仪器和试剂基本上同圆柱电泳相似。只是该法所使用的电泳槽是垂直板夹蕊式电泳槽或多用式电泳槽。目前使用较多的中国科学院动物所研制的夹蕊式垂直板电泳槽以及北京六一仪器厂制造的夹蕊式垂直板电泳槽和多用途电泳槽(图11－3)。
2．操作方法 为了便于读者掌握，现以水稻杂交种及三种胚或萌动胚电泳鉴定为例介绍如下。
(1)准备垂直板电泳槽 这种电泳槽的两侧为有机玻璃制成的电泳槽。其中有两片玻璃板构成的凝胶模夹在两电极槽中间。另外，在电极槽中分别装有白金电极丝和回形冷却玻璃管。
使用前，将电极槽和玻璃板洗净，并将玻璃板烘干，冷却后嵌入胶带凹槽中，使长玻璃板下端与胶带下边保持2－3mm的距离，以此缝隙使前后槽相通。为避免灌胶时，胶液从此狭缝漏掉，需先用电极缓冲液配制的1%琼脂糖封住，或者用少量分离胶液密封，或者用胶带框大小相同的玻璃纸浸湿贴在这边，赶去气泡放平，夹上两边电极槽旋紧，并在这边灌上水检查有无漏水。如水通过狭缝渗入凝胶夹里，则须重新准备。
(2)制胶 按圆柱电泳的制胶方法，先配制分离胶，用吸管或用烧杯将新配制的胶液灌入胶模中，小心操作不要产生气泡。将胶液加到距离玻璃板顶端约2－3cm处，然后小心地加上一层水(3－5mm)，让其聚合。
待分离胶聚后，除去上面水层，再加上1－1．5cm的浓缩胶，然后将样品槽梳子插入浓缩胶液上部，需插正和平整，至适合深度。其目的是使胶液聚合后，留有凹槽(样品槽)，以便加样。
(3)样品制备和加样 随机数取送验样品50－100粒，去壳，切下每粒胚，或者吸胀发芽24－48小时后用镊子尖挑出萌动胚，分别放入玻璃小匀浆器，每粒种胚放入一个小匀浆器，再分别加入50－100μl提取液(20%蔗糖的电极缓冲液)，充分研磨成匀浆，拔出研磨手柄，静置，让其在低温下澄清30分钟至数小时。
用微量进样器吸取上清液20－30微升，逐个加入样品槽里，各样品槽的加样数量要一致。
(4)加电极缓冲液和电泳 分别在前(上)槽和后(下)槽加上电极缓冲液，前槽电极缓冲液要加到淹没短玻璃板顶端3－5mm，但不能满过长玻璃板；后槽加到离长玻璃板顶端1－2cm，然后在前槽中加入1－2滴0．1%溴酚蓝指示剂。
接上电极，前槽接负极，后槽接正极，然后通电电泳。起初通过浓缩胶的电压以原厘米15伏或电流10mA／块，大约时间为30－45分钟；通过分离胶的电压为30／cm，或20mA／块，大约时间为1．5－2小时。
(5)染色 用长针注射器剥下胶板，注意不要剥破，用无离水冲洗后放入染色液中染色。
3．主要同工酶和蛋白质的染色方法
(1)酯酶染色 称取30mga－醋酸萘酯和30mg β－醋酸萘酯溶于3ml丙酮－水(1∶1)中，再加入60mg坚牢兰B或RR盐，然后加0．1N、pH6．5的磷酸缓冲液90ml，用作染色液。
将取下的凝胶板放入35－37℃的上述配好的染色液约40分钟，至酶带呈现桃红色，然后取出经蒸馏水漂洗后，放入7%醋酸脱色固定，直至各条酶带清楚，背景清晰为止。
(2)过氧化物酶染色 经我们试验，以联苯胺－醋酸－过氧化氢染色液的染色效果较好。其方法是要预先配好1#联苯胺－醋酸溶液：称取2g联苯胺溶解于18ml冰醋酸中，然后加入72ml的无离子水；2#配好3%的过氧化氢溶液。
当剥下胶板前，取1#液4ml和2#液1．6ml，再加76ml无离子水。即配成一块胶板的染色液。
在剥下胶板后，用无离子水冲洗清洁，浸入刚配好的染色液。在室温下待深蓝色酶带清晰为止，随着染色时间的延长，该酶带将变为深棕色至褐棕色。
(3)多酚氧化酶染色 预先配制1#液：1%邻苯二酚液；2#液：0．05N磷酸盐缓冲液(pH7．0)；3#液：0．06%对苯二胺液。
在染色前，取1#液3份，2#液1份和3#液1份的比例配制90ml染色液。将剥下的胶板浸入染色液，至棕褐色谱带清晰为止。
(4)酸性磷酸酯酶染色 预先配制1#液：0．2M醋酸钠溶液；2#液0．2M醋酸液；3#液：10%MgCl2溶液。
染色前，取1#液9ml，2#液41ml，然后加入50mg α－萘酯磷酸钠盐和50mg坚牢酱紫GBC，再加入5滴10%MgCl2液，即配成染色液。
将剥下的胶板浸入上述配好的染色液里，在30℃下染色1．5－2小时，或更长的时间，至酶带呈紫红色清晰为止。然后用50%酒精脱色2小时，再用7%醋酸保存。
(5)淀粉酶染色 淀粉酶染色分二步进行：第一步是将剥下的胶板浸入含有0．8%可溶性淀粉的0．07M磷酸缓冲液中，在30℃下渗入淀粉4－6小时；第二步是，倒去淀粉溶液，用无离水冲洗胶板面上的淀粉，然后加入Ⅰ-KI溶液(12g KI加1．2g I2／L)染色20－30分钟，则在蓝色背景上呈现出白色透明的酶带。因为在胶板中存在淀粉酶的部分已将渗入淀粉已被淀粉酶水分为葡萄糖而不被Ⅰ-KI染成蓝紫色而成为白色酶带。其他部分渗入的淀粉被Ⅰ-KI染成蓝色背景。在我们实际使用中，效果良好。
(6)细胞色素氧化酶染色先配染色液：取1ml 1%二甲基对苯二胺和1ml 1%α－萘酚混合后，加入＜5ml 0．1%磷酸缓冲液(pH7．4)。
然后将剥下胶板用无离子水冲洗后，浸入染色液中，在室温条件下放置40分钟，酶活性区出现蓝色酶带，再转入水中，可保存数天。
(7)酒精脱氢酶染色 先配染色液：在烧杯中混入2ml95%乙醇或其他醇，25ml辅酶Ⅰ(NAD)，15mg氮蓝四唑(NBT)，1mg吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)，7ml 0．2M Tris-HCl缓冲液(pH8．0)和41ml无离子水。
然后，将胶板(或柱)，用无离子水漂洗后，浸入染色液中，在暗处37℃下放置至酶活性区出现暗蓝色酶带。待显色后，用无离子水洗去染色液，并用10份乙醇，4份冰醋酸，2份甘油和8份水配成的固定液A中进行固定。
(8)苹果酸脱氢酶染色先配好染色液：烧杯中混入5ml1M L－苹果酸钠(pH7．0)，25mgNAD，15mgNBT，1mgPMS，10mlTris-HCl缓冲液(pH8．0)和35ml无离子水。
然后，将胶板用无离子水冲洗后，浸入染色液中，在暗处37℃下放置酶活性区出现深蓝色酶带。染色后再用无离子水洗涤，并放入固定液A中固定(见上酒精脱氢酶)。
(9)过氧化氢酶染色 先配好染色液，在20份0．05M磷酸钾缓冲液(pH7．0)中加入2．5份二氨基联苯胺(4mg／ml)水溶液和1份过氧化物酶(1mg／ml)水溶液混合而成。
然后将胶板用无离子水冲洗后，浸入染色液中，在23℃下放置4－5分钟，倒去染色液，并用无离子水漂洗，再倒入含有0．6%H2O2的0．05M磷酸钾缓冲液(pH7．6)中，在23℃下直至棕色凝胶背景上出现白色酶带。洗去H2O2液后，放固定液B(5份蒸馏水，5份甲醇和1份冰醋酸混合液)中固定。
(10)乳酸脱氢酶染色 方法Ⅰ：吸取烟酸胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)50mg，硝基蓝四唑(NBT)30mg，吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)2mg，0．5M缓血酸胺－盐酸缓冲液(pH7．4)15ml，1M乳酸钠10ml，0．1M氯化钠5ml，加重蒸馏水至100ml配成染色液电泳毕，将剥下胶板放入染色液中染色60分钟左右，待显现出蓝紫色的同工酶谱带，水洗后浸入50%－70%乙醇中保存。
方法Ⅱ：取1M DL－乳酸钠盐溶液(pH7．0)5ml，NAD25mg，NBT15mg，PMS1mg，加0．2M Tris-HCl液(pH8．0)10ml，再加水35ml，配成染色液。将凝胶放在染色液中37℃黑暗下保温1小时左右，酶活性区带呈现深蓝色。
方法Ⅲ：称取NAD12．5mg，NBT7．5mg，PMS0．5mg，加入1M乳酸钠2．5ml，0．1M NaCl1．3ml，0．5M Tris-HCl缓冲液(pH7．5)3．8ml，加至25ml。显色后，将凝胶放在7%醋酸中固定10小时左右，然后置于20%甘油中保存。
注：1M DL－乳酸钠盐溶液(pH7．0)的配制：称取6．07gNaCO3·H2O溶解于50ml水中，置冰浴中，并在搅拌时缓慢加入(一滴滴的加)85%的DL－乳酸10．6ml，然后加水至100ml。
(11)异柠檬酸脱氢酶染色TVB〔Tris60．6g+EDTA(乙二胺四乙酸钠)6．0g+硼酸40．0g，溶解于1000ml水中，pH8．0〕缓冲系统：加NADP(辅酶Ⅱ)20mg于凝胶混合液。
染色液：0．1M、pH7．0异柠檬酸钠盐(该钠盐25．8g／100ml水，用1N HCl将pH调到7．0)8ml，NADP(辅酶Ⅱ)15mg，NBT15mg，PMS1mg，MgCl250mg加0．2M Tris-HCl(pH8．0)10ml。加水32ml配成。
显色：将剥下凝胶浸入染色液中，在37℃黑暗下保温，至呈现深蓝色酶带为止。
固定：凝胶用水漂洗后，用50ml乙醇凝胶洗涤液固定。
(12)ATP酶染色 取0．1mM、pH8．0Tris－甘氨酸缓冲液100ml，ATP0．3116g，CaCl20．555g配成染色液。将凝胶板浸入染色液中，在30℃保温4小时以上，显乳白色酶带为止。
(13)6－磷酸葡萄糖酸脱氢酶染色 称取6－磷酸葡萄糖酸(三钠盐)100mg，NADP(辅酶Ⅱ)15mg，NBT15mg，PMS1mg，MgCl250mg，加入0．2M Tris-HCl，pH8．0 10ml，再加水40ml配成染色液。将凝胶板浸入染色液中，在37℃黑暗中保温，至呈现深蓝色酶带为止。
(14)谷氨酸草酰乙酸转氨酶染色 在室温下，依次溶解下列组分：0．2M Tris-HCl(pH8．0)50ml，吡哆醛－5′－磷酸盐1mg，l－天门冬氨酸200mg，α－酮戊二酸100mg，坚牢蓝BB300mg，配成染色液，并用1N NaOH将pH调节到7．8－8．0之间。将凝胶浸入染色液中在37℃保温直至呈现棕色酶带为止。水洗后，用50ml甘油和水(1∶1)固定。
(15)谷氨酸丙酮酸转氨酶染色 称取NADH(辅酶Ⅰ)15mg，L－丙氨酸20mg，α－酮戊二酸10mg，加入0．2M TrisHCl(pH8．0)1ml，再加水4ml和乳酸脱氢酶150个单位。然后将上述溶液用巴斯德吸液管一滴一滴地加在凝胶板上，让该混合液渗入凝胶中，在紫外光(375nm)下观察并注意整个胶面上的荧光。出现荧光的暗带即为酶带。可立即通过一个黄色滤光镜拍照。
(16)肽酶染色 称取0．2M Tris-HCl(pH8．0)液25ml，水25ml，加MgCl250mg，邻联大茴香胺(二盐酸盐)50mg，过氧化物酶1500单位，蛇毒10mg，待全部溶解后再加入80mg2或3肽作底物(如甘氨酰－L－亮氨酸，L－亮氨酰－L－丙氨酸，L－亮氨酰－L－甘氨酰－甘氨酸)配成染色液。将凝胶浸入染色液，在室温下过夜(或至少6小时)，至呈现褐色酶带。水洗后用50ml甘油和水(1∶1=v／v)混合液固定。
(17)α－半乳糖苷酶染色 称取4－甲基伞形酮－α-D－吡喃半乳糖10mg，0．5M柠檬酸盐－磷酸盐(pH4．0)2．5ml，加水2．5ml，配成染色液。将凝胶浸入染色液中，在37℃保温45分钟。水洗后，在凝胶表面喷洒7．4N NH4OH，在长波长紫外光下(375nm)观察，记录荧光带作为酶带。可立即通过一黄色滤光镜拍照。
(18)葡糖－6－磷酸脱氢酶(G6PCH)染色 TVB缓冲系统：加20mlNADP(辅酶Ⅱ)于凝胶混合液。
称取葡糖－6－磷酸(二钠盐)200mg，NADP15mg，NBT15mg，PMS 1mg，MgCl250mg，加入0．2M Tris-HCl(pH8．0)液10ml，再加水40ml配成染色液。将凝胶浸入染色液中，在37℃黑暗中保温，直至呈现蓝色酶带为止。水洗后用50ml乙醇凝胶洗涤液(乙醇1000ml+乙醋400ml+甘油200ml)进行固定。
(19)葡糖磷酸异构酶(GPI)染色 称取果糖－6－磷酸(钠盐)80mg，NADP(辅酶Ⅱ)10mg，PMS1mg，MTT(甲基噻唑基四唑)10mg，MgCl240mg，加入0．2M Tris-HCl(pH8．0)25ml，加水25ml和葡糖－6－磷酸脱氢酶80单位配成染色液。将凝胶浸入染色液中，4℃黑暗下保温至呈现深蓝色酶带。水洗后，在50ml甘油和水(1∶1=v／v)混合液中固定。
(20)6－磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)染色 TVB缓冲系统：加入20mg NADP于凝胶混合液中。
称取6－磷酸葡萄糖酸(三钠盐)100mg，NADP15mg，NBT15mg，PMS1mg，MgCl250mg，加入0．2M TrisHCl(pH8．0)液10ml，再加水40ml配成染色液。将凝胶浸入上述染色液中，在37℃黑暗下保温，至呈现深蓝色酶带为止。水洗后浸入50ml乙醇凝胶洗涤液中进行固定。
(21)醛缩酶染色 称取果糖1，6－二磷酸(四钠盐)275mg，NAD25mg，NBT15mg，PMS1mg，砷酸钠75mg，加0．2M Tris-HCl(pH8．0)液10ml，加水40ml以及甘油醛3－磷酸脱氢酶100单位配成染色液。将凝胶浸入上述染色液，在37℃黑暗下保温，至呈现深蓝色酶带。水洗后，固定在50ml乙醇凝胶洗涤液中。
(22)腺苷脱氢酶染色 称取腺苷40mg，NBT15mg，PMS5mg，砷酸钠50mg，加入0．2M Tris-HCl(pH8．0)液1ml，再加水4ml，，黄嘌呤氧化酶1．6单位和核苷磷酸化酶5单位配成染色液。用巴斯德吸管将上述溶液滴在凝胶上，并浸没凝胶，让混合液掺入胶内，在37℃黑暗中保温，至呈现深蓝色酶带。冲洗和固定同前。
(23)延胡索酸酶染色 称取延胡索酸(钠盐)385mg，NAD40mg，NBT15mg，PMS1mg，加入0．2M Tris-HCl(pH8．0)液10ml，加水40ml，苹果酸脱氢酶600单位配成染色液。将凝胶浸入上述染色液中，37℃黑暗保温。至呈现深蓝色酶带。冲洗和固定同前。
(24)α－磷酸甘油脱氢酶(α-GPDH)染色 制备底物溶液：1．0M α－甘油磷酸钠，pH7．0(21．6g／100ml水)，用1NHCl调节pH至7．0)。
配制染色液：称取上述底物溶液5ml，加NAD25mg，NBT15mg，PMS1mg，再加入0．2M Tris-HCl(pH8．0)液10ml和水35ml配成。
显色：将凝胶浸入染色液中，37℃黑暗保温，至呈现深蓝色酶带。
洗涤和固定：同前。
(25)核苷磷酸化酶(NPE)染色 称取肌苷100mg，NBT15mg，PMS5mg，砷酸钠100mg，加入0．2M Tris-HCl(pH8．0)液10ml，水40ml，黄嘌呤氧化酶1．6单位配成染色液。将凝胶浸入上述染色液中，37℃黑暗中保温，至呈现深蓝色酶带。其余同前。
(26)亮氨酸氨肽酶染色 称取40mgL－亮氨酰β－萘酰胺盐酸，50mg氨基黑钾盐和100ml0．2M Tris－顺丁烯二酸盐缓冲液(pH6．0)配成染色液。将凝胶浸入上述染色液中染色1小时。其余同前。
(27)γ－谷氨酸移换酶(γGT)染色 在临用前称取5mg固酱GBC溶于5ml pH4．7醋酸缓冲液中配成染色液。将凝胶浸入固酱GBC溶液中，约15分钟显色后，移置5%醋酸液中固定。
(28)磷酸甘油酸激酶(PGK)染色 称取3－磷酸甘油酸(钠盐)10mg，NADH15mg，ATP10mg，MgCl25mg，EDTA1mg，溶于0．2M Tris-HCl(pH8．0)1ml，加水4ml，再加入甘油醛－3－磷酸脱氢酶100单位配成染色液。将凝胶浸入上述染色液中，在长波长紫外光(375nm)下观察，并注意整个胶面均匀的荧光，酶带显现为荧脱光带。
(29)磷酸葡萄糖变位酶(PGM)染色 称取葡萄糖－1－磷酸(二钠盐)300mg，NADP15mg，MTT20mg，PMS1mg，MgCl250mg，加入0．2MTris-HCl(pH7．0)液10ml，水40ml和葡萄糖－6－磷酸脱氢酶80单位配成染色液。将凝胶浸入上述染色液中，37℃黑暗中保温至呈现深蓝色酶带。冲洗和固定同前。
(30)RNA酶染色 称取酵母RNA250mg，黑钾盐100mg溶于0．05M醋酸缓冲液(pH5．0)100ml，加磷酸酶10mg配成染色液。将凝胶浸入上述染色液中，在37℃保温，至呈现蓝色酶带。然后用水冲洗，放入5%醋酸液中保存。
(31)可溶性蛋白质染色
1)氨基黑染色法 称取0．25g氨基黑10B，用7%醋酸溶解，至250ml。一般在室温下固定和染色5－10分钟至蛋白质谱带清楚为止。
2)考马斯亮蓝染色法 称取0．5g考马斯亮蓝R250或G250，用于182ml50%甲醇和18m1冰醋酸混合，并至200ml。或者用6%醋酸的1%G250溶液进行固定和染色5－10分钟。
3)1－苯胺基－8－萘磺酸染色 将剥下凝胶浸入2N盐酸中固定几秒钟，然后移入pH6．8的0．1M磷酸盐缓冲液(含有0．003%1－萘胺基－8－萘磺酸)染色3分钟。
4)其他染色法 将凝胶浸入12．5%三氯醋酸中固定30分钟，然后用0．1%考马斯亮蓝R250或0．05%氨基黑10B(用12．5%三氯醋酸配成)染色2－3小时，再经12．5%三氯醋酸脱色，直至背景清晰为止。蛋白质谱带呈现出蓝绿色或蓝色。
(32)游离组蛋白染色 将凝胶浸入12．5%三氯醋酸(用7%醋酸配)中固定2小时，然后浸入染色液(1．25g考马斯亮蓝R250溶于454ml5%甲醇后，再加入46ml冰醋酸)中染色30分钟。然后进行脱色。将凝胶浸入脱色液(75ml冰醋酸加50ml甲醇，再用蒸馏水稀释到1000ml)中，在30－35℃下扩散脱色，直至凝胶背景漂白为止。组蛋白呈现蓝绿色。
4．脱色和保存 经染色后，如嫌胶板底色太深而谱带不够清晰，则可用有关脱色液，脱色数次，然后放入适用的保存液保存。
5．干胶板制作技术 如需将胶板作永久性保存，可将经7%醋酸液存放的胶片，用清水漂洗去醋酸，放在稍大于胶片的清洁玻板上垫有湿透明玻璃纸上，放正胶片，再盖上另一张透明玻璃，并在四周压上玻璃条，并用夹子夹牢。但须注意，玻璃纸要平整，在玻璃纸与胶片之间不能有气泡。然后放入40－50℃烘箱缓慢干燥或自然干燥。干燥温度过高容易破裂。
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