原生质体游离程序
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第64页（7105字）
(一)渗透条件
原生质体直接释放到标准细胞培养基中会破裂，因此，由植物细胞壁机械地维持着的压力用适当的渗透压代替之。细胞的外部和内部之间的渗透压必须平衡，或者细胞转移到渗透溶液中会引起对植物细胞的压力。已观察到，当渗透压太高时，代谢和生长减弱。这可用通过质膜的氨基酸吸收降低和细胞壁再生作用下降而测知。新细胞壁物质的合成作用受渗透作用的种类和浓度的影响。因此，当游离时，原生质体正好稍发生质壁分离。表3-3摘要了普遍使用的原生质体游离溶液。
表3-3 原生质体游离溶液
用加各种糖或糖醇控制原生质体的游离和培养用的溶液渗透压。甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖是极普遍地被采用。甘露醇和山梨醇或及其组合最常用，对于叶原生质体游离宁可用甘露醇。为了培养细胞作为可选择的这些六碳矿，已成功地采用了葡萄糖，矿质盐，特别是KCl和CaCl2也可采用，但是从未充分证明。因此，宁可选择甘露醇或山梨醇。
当原生质游离时，已成功地采用的甘露醇浓度为0．23—0．90M。有效的渗透浓度决定于原生质体游离期间叶细胞渗透压。内源细胞渗透压明显地受环境条件的影响，并且能用暗处理植株和幼叶组织等加以控制。
原生质体培养基中加入适当的代谢上活跃的渗透稳定剂(如葡萄糖和蔗糖)，以及代谢上不活跃的渗透稳定剂(如甘露醇)。活跃物质在早期生长和细胞壁再生时，逐步被代谢利用掉，导致渗透压的逐步下降。当再生细胞转移到再生营养培养基中时，渗透潜力会突然变化。
(二)受体组织
虽然，原生质体游离最常用的是叶组织，而许多其他植物组织也用于原生质体游离(表3-4)。对多数组织而言，原生质体游离用酶的常用类型和浓度是相似的。即使一些组织如糊粉层、根尖或花粉细胞都需要很高浓度酶液，或较长培养时间才能释放原生质体。例如，用叶组织相同的酶浓度，花粉四分体的原生质体在30h内尚不能释放出原生质体。
表3-4 各种植物的原生质体游离
当从完整植株组织游离原生质体时，植株的生长环境对原生质体成功培养是重要的。Watts等(1974)已证实，植株环境对烟草叶原生质体的成功培养是紧要的。植株必须在22℃，15h的10000—20000lx光照和每周施用高氮肥的理想环境中迅速生长。夏天时，重要的是降低光强度。这些作者已观察到，植株年龄对成功的原生质体游离也是极关重要的。植株年龄大于或小于40—60天对原生质体游离是不合适的。这些作者提出，已开花的植株，原生质体释放少同其衰老有关。当比较三个烟草品种时，已看到在原生质体释放上的明显差异。
同样地，Shepard和Totten(1977)主张，特殊的植物生长环境对马铃薯原生质体培养物的持续生长和发育是必需的。在原生质体游离之前，生长室中生长的马铃薯块茎产生了马铃薯植株。原生质体游离前的4—10天里，植株维持在12h的150001x高光强条件下，然后植株转移到每天6h的70001x低光强度下。植物始终保持在24℃和70—75%相对湿度下，并每天施用稀肥料溶液(1g／l20—20—20肥料)。改变这个程序便降低了马铃薯原生质体的活力。
高和Michayluk(1980)建立了苜蓿原生质体释放的适宜条件。叶子取自保持在21℃，12h光照和每周施肥的生长室中的植株。12000lx是宁可提出的高光强度的。取下叶并在黑暗12h后进行原生质体游离。从4片连在一起的叶释放原生质体来确定叶龄对原生质体能力的影响。老年叶需要较长的保温时间，最年幼苜蓿叶原生质体具有最高的植板效率。游离前植株生长条件，对茄子原生质体释放也是至关重要的。植株生长在26℃的7500lx16h光照下。仅带有4片以下叶的幼小植株才用于叶肉原生质体游离。同样地，游离水稻叶原生质体也要求幼小植株。
从栽培作物(如番茄)原生质体再生植株时特别关心直接生长在原生质体释放的适宜条件下的受体植株。Shepard(1981)已建立类似于马铃薯植株前处理的程序，适宜于番茄的原生质体释放。植株维持在高光强度下，每天12h光照，温度24℃，70—75%相对湿度，环境条件同马铃薯植株相同。原生质体分离前7天，为了原生质体释放，番茄植株转移到30℃和仅500lx每天16h光照条件下。Cassells和Barlass(1978)也强调为了适当的原生质体释放，番茄植株必须生长在低光强度下。通常施CaNO3肥料。Tal和Watts(1979)观察，当番茄植株生长在82%相对湿度和保持在低温下，可得到适宜的原生质体释放。
离体组织的预保温和受体植株生长在适宜条件下结合，增加了原生质体的释放和活力。高和Michayluk(1980)发现，假如去下表皮的幼叶在浸入水解酶液前先放到培养基上培养，苜蓿原生质体的产量显着增多。幼叶在富含葡萄糖、木糖、丙酮酸钠、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸和生长调节物质(2，4一D和ZEA核苷等)的改良细胞培养基中，放在黑暗下培育36—48h。所有已试验植株的预培养都导致显着高的植板效率。
因此，为了原生质体的成功释放，受体植株的生长条件是重要的，有些研究者，用离体苗培养体产生有效叶材料用于大规模原生质体游离。Binding(1974，1976)用苗培养体分别作为矮牵牛和烟草原生质体的来源。Scnieder(1977)为了常规原生质体分离用矮牵牛一些种的苗培养体，它们具有植株再生能力。为了在体细胞杂交中使用这些原生质体，把缺叶绿素和正常苗，都保持在补充4．4μM BA的B5培养基上。缺叶绿素南洋金花苗生长在500lx，而野生型蔓陀罗培养在3000lx下。全部培养物都保持在15—18℃的14h光照下。
Negrutiu和Mousseau(1980)建立了原生质体游离的林烟草苗培养体。用保持在含0．01μM NAA和0．3M蔗糖的MS培养基上的苗培养体，得到了最高的原生质体产量。确定2500lx是原生质释放的适宜光强度。从苗培养物释放的原生质体已是无菌，因此无需在原生质体释放前再用次氯酸钠溶液处理。
和从完整植株游离原生质体一样，从细胞悬浮体和愈伤组织培养体释放原生质体也依赖于受体细胞的生长环境条件。Wallin等(1977)讨论过Haplopapus gracilis细胞悬浮培养物的成功前处理，提高了原生质体产量。在28℃下，每2—3天继代培养细胞和在60rpm振荡的细胞，得到了适宜的生长条件。继代到新培养基3天后，原生质体产量下降。许多培养基成分影响原生质体产量。提高生长素浓度，特别是NAA增加原生质体产量。糖的种类和浓度也重要。在游离前一天，假若把细胞继代培养到降低蔗糖浓度或用葡萄糖取代蔗糖的培养基上，原生质体产量提高。另外，当向培养基中加入半胱氨酸、甲硫氨酸和2-硫氢乙醇，提高了原生质体产量。在改善原生质体产量方面，化合物无协同作用。Wallin等(1977)指出，前处理改变了植物细胞壁的化学成分，所以，原生质体释放须要较少量酶，从而可降低酶的毒性影响。
Fukunaga和king(1978)查明了氮源对许多作物原生质体释放的影响。他们试验了用硝酸氨盐、谷氨酸和天门冬氨酸作为唯一氮源。在硝酸钾培养基上细胞生长好，而在硫酸铵中生长最差。然而，在硫酸铵培养基中培养的苜蓿、亚麻、水稻、大豆、烟草和小麦其原生质体释放好。谷氨酸培养基对大豆细胞培养体的原生质体释放一样适合，而天门冬氨酸对水稻也一样适合。已指出生长在硝酸盐中的细胞阻碍酶的活性。
当同从整株植物游离原生质体相比，从培养细胞游离原生质体有有利的一面，也有不利的一面。培养细胞早已是无菌的。由于培养细胞早已在离体条件下生长，当培养原生质体时，就不难诱导细胞分裂。正如在Haplopappus上的报道，能确实地控制培养条件来增进原生质体释放。另一方面，培养细胞有频繁的异倍体出现，它削弱了以后的植株再生。
为了减小酶的决定性影响，在酶处理之前常将叶组织质壁分离。这种处理表明，提高了活原生质体的复原。假若在加酶之前，让其处在等渗溶液中1h，原生质体更稳定。预质壁分离显着降低了电解质的泄漏，否则在原生质体游离时发生泄漏，会防止外源酶进入胞质和减少渗透的冲击。
(三)培育方法
原生质体释放目标是除去细胞壁而不损害细胞活力，游离条件对取得成功是极其重要的。已了解到很多因素影响原生质体释放的数量或质量，这些因素包括：pH、光强、温度、培养时间、渗透浓度和类型，以及使用的保护化学药品。如同上面所讨论的，商品酶制剂包括许多水解酶类，它可能损伤植物细胞。酶的伤害效应能随减少酶处理时间而减到最小。因此，游离条件的变化影响原生质体产量和活力是不奇怪的。假若温度升高，可缩短酶处理时间。另外，假若温度低到l0℃，培养时间必须延长。为了成功游离，许多程序采用过多种温度。虽然，已了解温度变化无常，没有意见一致的程序被采用。例如，Potrykus等(1977)建议为了适当的原生质体释放，玉米节间切段在12℃下，暴露到酶中16h，然后在32℃下6h。另外，同时，Vasil和Vasil(1980)建议在室温下培养1h，然后在14℃下培养19h。
光对原生质体游离的影响，通常在黑暗或在低光强下游离原生质体。酶游离溶液的pH变动明显，通常在5．4—6．2之间。已指出较高pH(6．0—7．0)最有利于释放菜豆的叶肉原生质体。虽然，较低pH(5．8)用于释放大豆叶肉原生质体。报道了当原生质体游离时，振荡对静止酶处理的类似变化。一般而言，振荡用于细胞悬浮培养物的原生质体释放，而静止培养常用于游离叶原生质体。因此，原生质游离的环境条件常常是十分重要的，但是所采用的方法要确定这些适宜条件主要地靠经验。
用酶混合液处理组织来游离原生质体，它们包括了盐类，或在有些情况下是一种完全培养基，一种缓冲液，和一种渗透稳定剂。加入较高浓度如6．0rnM氯化钙，提高了原生质体膜稳定性。氯化镁对稳定的原生质体释放也有效应。当酶直接溶解到原生质体培养基减少对原生质体的冲突作用，否则从游离液转移到培养基中会发生这种冲击作用。酶游离溶液也可包括磷酸盐，或MES缓冲液，使原生质游离过程中可能发生的pH向酸性变化减到最小。还有当原生质体游离时，细胞破裂释放出的水解酶，会损伤原生质体。0．5%葡聚糖硫酸钾抵制酶粗制剂中混杂蛋白质，把它加到原生质体溶液中减少原生质体损伤。
(四)纯化步骤
经酶处理后，得到了未消化细胞、破碎或损伤的细胞和原生质体的混合物。混合物经部分地纯化以除去破损的和未消化的细胞。采用了大量技术，取得成功程度不同。
最常用的提纯技术是过滤浓缩。原生质体混合物通过滤器过滤，一般用40—100μm孔径，保留着未消化细胞、细胞群落和维管束组织。滤液中的原生质体细胞碎片用离心法分升。离心速度一般是100×g能有效地沉淀原生质体，而细胞碎片继续上浮。轻轻倒上清液，便得到提纯的原生质体制剂，把它再悬浮并培养在原生质体溶液培养基上。当整个纯化过程用相同渗透溶液，同其他原生质体纯化技术相比，过滤是有利的。另外，当通过过滤时，原生质体易受影响而破损，因此，不用过滤法制备原生质体。但为了细胞培养体原生质体和大多数叶肉原生质体的游离，这个方法是有用的。
叶肉原生质体特别脆弱，过滤导致压碎细胞。重要地是一些植物用漂浮法纯化叶肉原生质体。当同含有的细胞器或细胞壁部分相比较，原生质体密度相当低，采用多种梯度对原生质体漂浮是有效的，并使残渣沉淀。用蔗糖或山梨醇的浓溶液同酶原生质体混合物加在一起，把它用适合的速度离心，原生质体重新出现在离心管的顶部。蔗糖浓度变化在0．3M之间。茄属和烟草属用350×g离心3—10min。番茄的离心速度必需降到40—30×g。拟南芥属和玉米用山梨醇代替蔗糖。在多数情况下，未广泛地检查漂浮程序。通常，已有报告仅包括一个离心速度的单一蔗糖浓度。这个方法也在不大脆弱的原生质体离心之前，结合采用过滤步骤或在离心之后，还采用凝胶过滤步骤。用蔗糖漂浮方法，原生质体破损较少。但在某些情况下，由于渗透压的冲击也可伤害原生质体。用这个方法，原生质体最重要的变化是蔗糖或山梨醇的浓度和离心速度，两者都影响脆弱原生质体的稳定性。
为了原生质体游离，已建议了大量其他的梯度。用顶部6%和下部9%的二级Ficoll，溶解在7%山梨醇的MS培养基中，在150×g下离心5min用来提纯胡萝卜悬浮培养体的原生质体。经过离心叶绿体、维管束分子和有壁细胞等残渣沉淀在离心管底部，而原生质体浮在离心管顶部。Ficoll梯度也用于其他一些种的原生质体提纯。
用若干不连续梯度提纯原生质体。通常，原生质体混在含高分子量物质的酶游离溶液中，在两个相之间重新出现有一层完整原生质体。Wernicke等(1979)把原生质体混合物放在带0．25M甘露醇和0．1M CaCl2的20%Percoll(聚果糖)中进行分层。200×g离心后，Hyosc yamus muticus原生质体重新出现在Perco1l之上。和这些高分子量物质一样，象Ficoll和Percoll是渗透上无活性的，用它们作漂浮比用蔗糖更可取。使用这些梯度，整个游离过程保持同样的渗透强度。Kanai和Edwards(1973)用葡聚糖—聚乙二醇的二相系能得到多种植物的完整原生质体。仔细审查了这个方法，PEG对聚积植物原生质体是第二位效应。同样地，黑麦草属原生质体集积在Sepharose J539空隙中。在相分隔处集积原生质体也可用蔗糖和山梨醇混合物实现。用与0．36M山梨醇混合0．5M蔗糖和0．14M蔗糖之间的相边界上集积着大麦原生质体。
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