微量生化板反应法
出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《临床厌氧菌检验手册》第159页（2675字）
微板法是笔者根据预成酶活性测定原理于1986年首先在国内研制成功的方法，以后被人们干燥制成商品。笔者将就在这一方法做些介绍，供国内检验和科研人员采用。
1．被鉴定菌株的浓菌液的制备
(1)一般革兰氏阴性无芽孢杆菌因灭菌蒸馏水(pH7．0～7．2)2ml盛入灭菌小试管中，定量刮取琼脂平板上分纯的菌苔，制成10～30亿／ml浓菌液。
(2)革兰氏阳性厌氧菌用pH7．2肉汤酵母浸液2ml盛入无菌的小试管中，定量刮取琼脂平板上分纯的菌苔，制备成30亿／ml以上的浓菌液。
2．糖发酵液、蛋白胨水和硝酸盐等溶液的制备
(1)多类糖发酵液，以pH值7．0的蒸馏水10ml加入多种糖基质一定浓度混均，滤过灭菌。
(2)以1／15M磷酸盐缓冲液10ml(pH值6．8)加入胰酪胨0．1g，滤过灭菌，即为检测吲哚的蛋白胨水；或加入KNO3配制硝酸盐还原检查液；或加入枸橼酸铁0．2g及七叶灵0．1g，配制七叶苷水解液；或加入尿素4g及0．4%酚红水溶液配制脲酶检查液；及加入0．3g淀粉为淀粉酵解液。配制液可贮存于4℃冰箱中，15～30天不变质。
·新药介绍
丽珠肠乐
(口服双歧杆菌活菌胶囊，Bifidobigen)
丽珠肠乐是我国微生态调节剂的代表药物，其有效成分双歧杆菌是一种革兰氏阳性无芽孢厌氧杆菌，在人体具有重要的生理作用，是肠道菌群中优势种群之一。丽珠肠乐是国内首项Ⅰ类微生态制品，其工艺技术、质量、疗效等都达到国际先进水平，已列为国家级高新技术火炬计划的重点建设项目。1993年11月份，卫生部科技司委托8位专家对丽珠肠乐进行了项目评估，认为丽珠肠乐的诞生标志着我国微生态调节剂的研究进入了一个新阶段，其各方面已达到向全国推广的条件，特将丽珠肠乐列为我国首项卫生高新技术推广项目。
药理作用：调整菌群紊乱，清除腐败细菌，改善微生态环境；参与构成肠粘膜生物学屏障，增强屏障功能；补充有益菌群，增加双歧杆菌因子；拮抗各种肠道致病菌；增强和调节机体免疫功能；减少内毒素来源，降低血中内毒素水平；延缓肝组织纤维化进程；参与合成维生素B，补充多种氨基酸等营养物质。
安全、无毒、无副作用。
适应证：①防治各种原因(如疾病、外科手术、放化疗、大量使用抗生素等)所致菌群失调的首选药物。②防治菌群失调所致多种疾病(急慢性肠炎、腹泻、便秘等肠功能紊乱)的首选药物。③用于血内毒素水平升高的疾病(如急慢性肝炎、肝硬化、肝癌)的辅助治疗(基本药物)。④为外科手术术前及术后预防脓毒症、内源性感染或治疗的首选药物之一。可与许多抗生素配伍使用。
附：使用广州经济开发区丽康生物工程有限公司XZF20A或10A厌氧菌快速生化鉴定条鉴定方法。
(1)XZF20A即由A、B两条生化条组成，A条从1→10，B条从11→20，共可以测定22种生化性状。而XZF10A是简易鉴定法(用于10～12种生化性状鉴定)，分为革兰氏阴性杆菌、球菌，革兰氏阳性杆菌和球菌及梭菌五大类。此条简易，操作方便，价廉，值得推广。
(2)操作方法：①同于前面的浓菌液的制备；②在生化条各小杯(孔)中滴入0．03～0．04ml浓菌液；③将生化条置于湿盒中，再将湿盒放于37℃培养箱中普通培养箱不需厌氧)，4～6小时观察结果。由于生化条的各杯(孔)中已加入了指示剂，故不必另加指示剂。
(3)结果判断：①糖发酵：黄色为阳性(+)；紫色为阴性(－)；②脲酶：红色为阳性(+)；黄色为阴性(－)；③七叶苷水解：变黑、无荧光为阳性(+)；淡红、不变色、有荧光为阴性(－)。④吲哚产生加库氏试剂，硝酸盐还原加甲、乙两液，方法同需氧菌，结果观察也相同。⑤触酶试验：在甘露醇孔或葡萄糖孔中加入3%H2O2水1～2滴，产气为(+)，不产气为(－)。⑥明胶试验：用连续细流水冲生化条小杯(孔)，液化被冲掉为阳性(+)；而不液化不易被流水冲掉为阴性(－)。
(4)注意双歧杆菌或乳杆菌测定时，用pH7．2肉汤酵母浸液制备浓菌液。
3．操作方法 取灭菌处理洁净的96孔有机玻璃板，在无菌条件下滴入2～3滴糖或其他基质至微孔中，再依次滴入浓菌液1～2滴至微孔中，对照将仅滴入无菌生理盐水或PBS液。用灭菌玻璃板盖好微孔板置37℃以下孵育箱中。4～6小时检查反应结果时加入0．5%～1%氯酚红液1～2滴，或BTB-MR指示剂(后者效果好)，观察颜色反应。
注意：
(1)吲哚、硝酸盐还原、七叶苷水解、淀粉水解、脲酶等检查时，不加入BTB-MR指示剂。吲哚产生加入Kovacs试剂(库氏溶液)，硝酸盐还原加入甲液(对氨基苯磺酸、醋酸)和乙液(α－萘胺和醋酸)，淀粉水解加入芦戈氏碘液检查，七叶苷和脲酶不加入指示剂。
(2)每次微板法的第一排微孔都用作对照，即只加入基质和灭菌生理盐水。以排除因试剂不纯或污染等所造成的假阳性。
4．结果记录 BTB-MR指示剂 砖红色为强阳性(+++)；淡红色为阳性(++)；黄色为阳性(+)；绿色(墨绿色)为阴性(一)；淡黄色或黄绿色为弱阳性(+，－)，宜参考对照判断。
5．标准菌株的质控 为准确使用微板法，应定时(次)检查1～2株国际标准菌株的生化性状，以观察方法的稳定性，做好质量控制。