微量凯氏(Micro-Kjeldahl)定氮法
出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第101页（3925字）
此法可应用于所有饲料。
样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨，氨又与硫酸作用，生成硫酸铵。在蒸馏过程中，加入氢氧化钠，使硫酸铵分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度，即可计算出样品的含氮量。
蛋白质是一类复杂的含氮化合物，其中每一种蛋白质都有其恒定的含氮量，平均为16%，由凯氏定氮法测出含氮量，再乘以系数6．25(即每含氮1克，就表示该物质含蛋白质6．25克)即为蛋白质含量。
试剂和器材
(1)浓硫酸(分析纯)。
(2)硫酸钾——硫酸铜混合物(K2SO4∶CuSO4·5H2O=3∶1或6∶1)。
也可用80克硫酸钾，20克硫酸铜(CuSO4·5H2O)与0．3克二氧化硒或0．34克硒酸钠(Na2SeO4)充分研细混合。
每克促进剂如果再加0．032克的氯化汞，可以加速赖氨酸和组氨酸的消化分解。
(3)2%硼酸溶液。
(4)40%氢氧化钠溶液。
(5)0．0100N标准盐酸(用邻苯二甲酸氢钾法标定或用恒沸盐酸准确稀释)。
(6)混合指示剂(田氏指示剂)：0．1%甲基红乙醇溶液和0．1%甲烯蓝乙醇溶液，按4∶1比例(V／V)混合。贮于棕色瓶中备用。
该指示剂在pH5．2为紫红色；pH5．4为暗蓝色(或灰色)，pH5．6为绿色。变色范围很窄，pH5．2～5．6，很灵敏。
(7)凯氏烧瓶(100毫升)。
(8)凯氏定氮蒸馏装置。
(9)容量瓶(25毫升、50毫升)。
(10)锥形瓶。
(11)吸量管(1毫升、2毫升、5毫升)。
(12)小量筒(10毫升)。
(13)电炉。
(14)微量滴定管。
(15)分析天平。
操作方法
1．样品处理：待测固体饲料，先磨细，置150℃烘箱内干燥2小时，冷却后备用。
2．消化：取50毫升凯氏烧瓶，准确称200毫克固体饲料粉末。置凯氏瓶中，再加入300毫克硫酸钾——硫酸铜混合物，然后加入化学纯浓硫酸3毫升，烧瓶口插一小漏斗(作冷凝用)。
取另一只凯氏烧瓶内加200毫克蔗糖(或不加)代替样品作空白测定，每次分析时都要另做空白对照，即一切处理与样品凯氏烧瓶相同，但不加饲料样品。
将样品和空白凯氏瓶置通风橱内的消化架或电炉上加热消化，开始时应控制火力，易使瓶内液体冲至瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始释出SO2白烟后，适当加强火力，直至消化液透明并呈淡绿色为止(约2～3小时)。冷却，小心沿管壁加水约10毫升稀释消化液，将消化液倾入50毫升容量瓶中，以少量蒸馏水冲洗消化瓶数次(三次以上)，全部倾入容量瓶内，然后用蒸馏水定容至刻度，反复颠倒混匀。
图2 微量凯氏蒸馏装置
1．煤气灯；2．蒸汽发生器；3．长玻璃管；4．橡皮管；5．小玻杯；6．棒状玻塞；7．反应室；8．反应室外壳；9．夹子；10．反应室中插管；11．冷凝器；12．锥形瓶
3．蒸馏：微量凯氏蒸馏装置，有几种不同的结构类型，但它们的原理相同，我们选择其中一种，说明其操作过程：
(1)安装好蒸馏装置，并检查各接头处是否漏气。
(2)打开冷凝管的水源，使水流通过。
(3)将蒸馏水加入蒸汽发生器中，再加几滴硫酸(使水微酸化)，甲基红和数块碎玻璃片或数段小玻璃管。塞紧橡皮塞，加热，使产生蒸汽。
(4)仪器的洗涤：通入蒸汽洗涤蒸馏器，蒸汽冲洗15分钟左右后，用蒸馏水冲洗棒状玻塞和小玻杯，使水冲入反应室中，并同时用手夹住蒸汽发生器的导管，使蒸汽不能通过，致使反应室外壳产生负压，将反应室的积水回吸到反应室外壳，再通蒸汽，如此反复数次，打开废液夹子，放出废液，并使废液夹继续开放。
(5)用50毫升锥形瓶10毫升2%硼酸溶液和3滴混合指示剂(溶液应呈紫灰色)，置于冷凝管下端为接受瓶，使冷凝管下口完全浸入硼酸溶液中。
(6)加样：吸取消化液5毫升(加样前废水夹应开放)，将棒状玻璃塞取出，小心将消化液通过小玻杯下方流入反应室中，并用少量水冲洗，然后将玻塞塞好。
(7)加NaOH：量取40%NaoH10毫升，加入小玻杯中(加碱时棒状玻塞不必提起)，加完后慢慢提起棒状玻璃塞(注意：夹子应开放，接受瓶应放好)，使NaOH慢慢流入反应室，见到有棕色或蓝色即停加碱。然后再用蒸馏水洗小玻杯中的碱，洗时始终保持小玻杯中有蒸馏水，以使水封。
(8)加热蒸汽发生器，待夹子开口有蒸汽时，才能关闭夹子。
(9)蒸馏：由接受瓶中溶液变绿色开始记时，蒸馏5分钟后，即将接受瓶放低，使冷凝管下端离开液面，用蒸馏水冲洗下端外侧，继续蒸馏1分钟。
(10)排除废液：用蒸馏水冲洗三次，空蒸3分钟，然后再测第二个样品。
4．滴定：用微量滴定管，以0．01N的HCl滴定接受瓶中的硼酸铵，使溶液由绿色突然转变成紫灰色时为滴定终点，记录HCl所用的毫升数。
5．空白滴定：如测定固体样品时，以蔗糖代替样品。如果测定液体样品时，则以蒸馏水或以0．9%NaCl液体代替样品，其量与样品相同。除以上不同外，其它操作包括消化、蒸馏、滴定等和样品测定完全相同(一般先作空白测定)。
5．计算：
式中：N：标准盐酸溶液当量浓度；
V1：滴定样品用去的盐酸溶液毫升数；
V2：滴定空白消化液用去的盐酸毫升数；
W：样品重量(克)；
14：氮的原子量(0．014：为氮的1个毫克当量)，
样品中蛋白质含量(%)=总氮量×6．25*
注：式中6．25为一般复合饲料的转换系数，但不同饲料转换系数略有不同。见表7。
表7 一些动、植物蛋白质的转换系数
一般认为复合饲料和肉类等动物性饲料转换系数为6．25，谷类饲料的平均转换系数为5．70，奶制品转换系数为6．38。
除蛋白质以外饲料中所含氮化合物，还有少量的氨基酸、胺类、嘌呤碱、嘧啶碱等物质，所以用上法测得的饲料蛋白质称为粗蛋白质。一般饲料测得粗蛋白质就可以了。
如果需要测定纯蛋白质总氮量，必须把非蛋白质的含氮物与蛋白质分开。一般多采用三氯乙酸等沉淀剂，将蛋白质沉淀析出，测定上清液的含氮量，即为非蛋白氮。测定方法也可采用微量凯氏定氮法。
蛋白氮=总氮－非蛋白氮
蛋白质含量=蛋白氮×6．25
说明：样品如为液体，可视含氮量的高低，取0．4～1毫升样品(含氮1～7毫克)。其消化、蒸馏、滴定等均同上。