Dansyl－氨基酸的聚酰胺薄层层析

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第141页（2566字）

N，N－二甲基－5－萘磺酸(Dansyl)与PCl₅反应生成N，N－二甲基－5－萘磺酰氯(Dansyl-Cl)，它溶于丙酮，在水中溶解度很小，它为芳香族磺酰氯，易产生荧光。可与各种碱基进行反应，形成稳定度不同的衍生物。

当蛋白质或多肽水解后产生的氨基酸与Dansyl-Cl(DNS-Cl)反应时，可形成Dansyl－氨基酸。多数氨基酸最适的Da nsyl化的条件是在pH9．5～10．5，pH值再增加时，则Dansyl-Cl易被水解，低于最适pH时，则降低氨基酸Dansyl化的程度。

DNS－氨基酸可在聚酰胺薄膜上层析，有荧光物质的氨基酸可借助紫外灯观察。

试剂

(1)标准氨基酸。

(2)0．5MNaHCO₃。

(3)N，N－二甲基－5－萘磺酰氯(Dansyl－Cl)。

(4)丙酮。

(5)展层剂：水∶甲酸(200∶3，V／V)。

苯：冰醋酸(9∶1，V／V)。

(6)5．7N盐酸。

(7)甲酸。

(8)无水甲醇。

(9)尼龙6(由己酰胺聚合而成)。

(10)尼龙66(由己二胺和己二酸聚合而成)。

(11)胶片。

(12)其他：紫外分析灯。

操作步骤

1．样品蛋白质的水解

(1)样品的脱脂：蛋白质中如含有脂肪应除去，加入适量乙醚，研磨后滤去乙醚，重复以上操作2～3次，将去脂蛋白质干燥。

(2)过甲酸氧化：称取25mg脱脂蛋白质，溶于0．5毫升甲酸中，加入少量甲醇，降温至－10℃，再加入0．1毫升过甲酸(1毫升30%H₂O₂和9毫升97%甲酸混合而成)，混合均匀后放置3小时，再进行冷冻真空干燥(如使用纯化的蛋白质样品，则不需要经过脱脂和过甲酸氧化)。

(3)水解：(取5～25mg处理后的样品或纯化的蛋白质，加入1ml重蒸的恒沸点的5．7N盐酸，水解管的开口处连接抽气泵，使水解管在减压的条件下用火焰封口。置110℃烘箱中水解24小时。

(4)水解液处理：样品水解后，水解液过滤、滤渣用蒸馏水洗涤两次，合并滤液，置蒸发皿中，在沸水浴上蒸干。加入少量蒸馏水溶解氨基酸，重复以上操作两次，直至水解产物中无盐酸气味为止。再用0．5毫升0．5MNaHCO₃将氨基酸溶解。

2．氨基酸的Dansyl化

(1)Dansyl-Cl溶液的配制：

取1毫克Dansyl-C1溶于1毫升丙酮(分析纯)中，避光、密封，低温保存。

(2)Dansyl化：

吸取40μl蛋白质水解处理液，加入80μlDansyl-Cl溶液，密封，于20℃保温8小时，再放入冰箱保存待用。

(3)标准氨基酸溶液的配制：每种标准氨基酸各取1毫微摩尔(1mμM)配成氨基酸混合液。

取40μl氨基酸混合液，加入40μl0．5MNaHCO₃，再加入80微升Dansyl－Cl溶液，密封，于20℃保温8小时，放入冰箱保存待用。

3．聚酰胺薄板的制备：

取胶片(胶卷片基)用洗衣粉刷洗干净，晾干后固定在瓷盘中。

再取20克尼龙6(由己酰胺聚合而成)或尼龙66(由己二胺和己二酸聚合而成)，置烧杯中，加入100毫升甲酸，可适当升温至50℃～60℃(勿超过80℃)，搅拌下使之全部溶解。溶解液缓慢倒在倾斜的胶片上，让其自然流下，在胶片上均匀分布，将瓷盘中的胶片放在潮湿的环境中，使聚酰胺薄板自然干燥后即可使用。(制成的薄板为7×7cm)。

4．Dansyl－氨基酸的分离与鉴定：取聚酰胺薄板(7×7cm)，在距薄板相邻两边各0．6cm的角上，用玻璃毛细管点样，点样直径不超过1．5mm。点样后在有盖的玻璃缸中进行双相层析。

第一相用水∶甲酸(200∶3，V／V)展层，展层后用热风吹干。

第二相用苯∶冰醋酸(9∶1，V／V)展层，展层后用热风吹干。

如果第一相展层不好，可连续展层两次再进行第二相展层。

展层后的薄板在紫外分析灯下观察(波长为365nm)，与标准氨基酸图谱对照，检出荧光点，确定样品中氨基酸的种类。

〔注〕聚酰胺薄膜：浙江黄岩化学分析材料厂和上海市试剂四厂均有成品生产。