维生素D的测定
出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第190页（3438字）
方法一：三氯化锑比色法测定维生素D
维生素D2和D3在氯仿溶液中与三氯化锑反应呈橙黄色。在500nm波长处具有最大吸收峰。可用比色测定，维生素D与维生素A共存时，需除去维生素A。方可进行比色测定。
试剂
(1)三氯化锑。
(2)氯仿。
(3)三氯化锑－氯仿溶液：取10克重结晶三氯化锑，加入50毫升氯仿。
(4)三氯化锑－氯仿－乙酰氯溶液：取上述三氯化锑－氯仿溶液，加入相当于其体积的3%的乙酰氯，混匀，此液可用5天。
(5)乙醚。
(6)乙醇。
(7)石油醚(30℃～60℃)。
(8)维生素D标准溶液：称0．25g骨化醇，用氯仿稀释至100毫升。此液每毫升相当于100000I．U．维生素D2(此液冰箱中可保存10天)。
工作液：临用时用氯仿配制成10～100I．U．／毫升的标准工作液(此液现用现配)。
〔注〕维生素D2(骨化醇)1．00g相当于40000000I·U．。
(9)聚乙二醇(PEG)600。
(10)白色硅藻土：Celite545。
(11)氨水。
(12)无水硫酸钠。
(13)0．5N氢氧化钾溶液。
(14)中性氧化铝(层析用)。
操作步骤
1．样品处理：同维生素A的测定。
2．皂化和提取：同维生素A的测定。
3．纯化：若维生素D和维生素A共存时，必须纯化除去维生素A。若无维生素A等干扰物存在时，可直接测定。
(1)层析柱的制备
①层析管规格：内径22mm，具砂芯板及活塞。
②称15g白色硅藻土(Celite 545)置250毫升碘价瓶中，加入80毫升石油醚，摇动2分钟，再加入10毫升聚乙二醇600，振摇10分钟，使其粘合均匀。
③向层析管内依次加入：10g无水硫酸钠，再注入上述粘合物、粘合物上端加入5g中性氧化铝，再加入少量无水硫酸钠。轻轻转动层析柱，使柱内粘合物高度保持在12cm左右。
(2)分离纯化
①装柱后先用30毫升左右的石油醚进行淋洗，然后将上述提取液转移至柱内，再用石油醚进行洗脱，弃去最初收集的10毫升，再用200毫升容量瓶收集洗脱液至刻度，洗脱液流速每分钟保持2～3毫升。
②将洗脱液放入250毫升分液漏斗中，加入过量的蒸馏水，剧烈振摇，分层后弃去水层，再加入过量的水重复振摇1次，弃去水层(水洗的目的主要是去除聚乙二醇，否则影响测定)。
③将上述石油醚层通过无水硫酸钠脱水，移入锥形瓶中在水浴上浓缩至5毫升左右，在水浴上用水泵减压至干，立即加入5毫升氯仿于10毫升具塞刻度试管内，摇匀，备用。
4．标准曲线的绘制
(1)分别吸取维生素D标准工作液(浓度按样品中维生素D含量高低而定)，0．0，1．0，2．0，3．0，4．0，5．0毫升，于10毫升容量瓶内，用氯仿定容至刻度，混匀。
(2)分别吸取上述标准溶液各1毫升于1cm比色皿中，立即加入三氯化锑－氯仿－乙酰氯溶液3毫升，在500nm波长处，在2分钟内进行比色测定(以氯仿作空白)
(3)以光密度为纵坐标，维生素D标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。
5．样品测定：吸取上述已经纯化的样品溶液1毫升置1cm比色皿中，立即加入三氯化锑－氯仿－乙酰氯溶液3毫升，在500nm波长处，在2分钟内进行比色测定，测定其光密度。
6．计算：
式中：V：层析纯化后，样品提取液总体积(毫升)；
A：从标准曲线查得，样品测定液维生素D含量(I．U．／毫升；
W：样品称重(克)。
方法二：紫外吸收法测定维生素D
维生素D溶于乙醇中，在265nm波长下，具有最大吸收峰，光的吸收度与维生素D的含量成正比。可进行定量测定。
试剂
(1无水乙醇。
(2)维生素D标准溶液：称0．25克骨化醇(1．0克骨化醇相当于40000000I．U．)用无水乙醇溶解并定容至100毫升。此液每毫升相当于100000I．U．的维生素D2。
工作液：临用前可用无水乙醇稀释成每毫升含1～100I．U的标准工作液。
操作步骤
1．样品处理：把的述的三氯化锑比色法所得到的抽提纯化液，置水浴上蒸发浓缩至1毫升左右，再在真空干燥器内抽干，迅速用无水乙醇溶解，并转移至50毫升容量瓶中，用无水乙醇定容。混匀。
2．测定：将以上纯化的样品液，用紫外分光光度计于265nm波长处，以无水乙醇为空白对照液，测定样品的光密度。
根据所测定的光密度值，从标准曲线查出相应的含量。
3．标准曲线的绘制
(1)分别吸取维生素D标准工作液0．0，1．0，2．0，3．0，4．0，5．0毫升，置10毫升容量瓶中，用无水乙醇定容，混匀。
(2)分别取各标准液于比色皿中，于265nm波长下，用无水乙醇作空白，测定其光密度。
(3)以光密度为纵坐标，以标准工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
4．计算：
式中：V：样品提取液总体积(毫升)；
A：从标准曲线查得的测定样液维生素D含量(1．U．／毫升)；
W：样品称重(克)。