胰蛋白酶活力与胰蛋白酶抑制物活性的联合测定
出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第201页（1899字）
大豆、生豆饼、利马豆、蛋清和甘薯等，均含有胰蛋白酶抑制物，该抑制物为一种球蛋白，可抑制胰蛋白酶活性。降低蛋白质消化率。
本方法采用BANA为底物测定胰蛋白酶活力，再测定胰蛋白酶抑制物，抑制酶的活力数，即为胰蛋白酶抑制物活力。
试剂
(1)0．25%BANA(苯甲酰－L－精氨酰－β－萘酰胺)的乙醇溶液(用75%乙醇)，保存于冰箱稳定期至少4周。
(2)0．2M，pH8．0磷酸盐缓冲液：吸取5．3毫升、0．2M磷酸二氢钠溶液，加入94．7毫升0．2M磷酸氢二钠溶液，混匀后，用pH计检查校正。
(3)0．1%亚硝酸钠溶液，临用前配制。
(4)0．05%N－1－萘基－乙二胺二盐酸的乙醇溶液：用75%的乙醇为溶剂配制，保存于冰箱可使用4周。
(5)0．5%氨基磺酸铵溶液：保存于冰箱可使用4周。
(6)2N盐酸。
操作步骤
1．胰蛋白酶抑制物的提取：称1克用研钵研碎的生豆饼或大豆粉(约100目)。置小烧杯中，加入25毫升0．2M、PH8．0的磷酸盐缓冲液，搅拌提取2小时。于4000转／分、低温(0～4℃)离心20分钟、量上清液总体积，备用。
2．胰蛋白酶的提取：取活草鱼或鲫鱼的消化道和肝脏，在冷处(冷室或冰浴中)剥去脂肪，排出肠道内容物，称重，置匀浆器中，按1克组织加入4毫升预冷的0．2M，pH8．0磷酸盐缓冲液，在冰浴中匀浆，然后在冰箱中(0～4℃)提取2小时，于6000转／分，低温离心20分钟(0～4℃)，量上清液总体积备用。
3．胰蛋白酶抑制物的活力测定：取3支试管，并分别编号。
1号管：此为空白管，加入0．1毫升，0．25%BANA乙醇溶液。加入0．4毫升pH8．0，0．2M磷酸盐缓冲液，再加入1毫升，酶提取液，然后加入0．5毫升2N盐酸溶液。
2号管：加入0．1毫升，0．25%BANA乙醇溶液。加入0．4毫升，pH8．0，0．2M磷酸盐缓冲液。再加入1毫升酶提取液。
3号管：加入0．1毫升，0．25%BANA乙醇溶液。加入0．4毫升，胰蛋白酶抑制物提取液。再加入1毫升酶提取液。
将以上各管均置于37℃恒温水浴中，保温15分钟。取出3支试管，并立即于2号3号试管中各加入0．5毫升，0．2N盐酸，停止酶反应。(1号管因已加过盐酸，故不再加)。
然后于3支试管中均各加入1毫升0．1%亚硝酸钠溶液，摇匀，置3分钟。加入毫升10．5%氨基磺酸铵溶液，充分摇荡，以除去过量的亚硝酸钠，放置2分钟。再加入2毫升0．05%，N－1－萘基－乙二胺二盐酸乙醇溶液。溶液逐渐呈蓝色，在25℃下，放置30分钟后，颜色稳定。
在721型分光光度计于560nm波长处，测定光密度值(以空白管调零)。
4．计算：
式中：O．D560：为样品管光密度值；
t：保温时间；
0．01：在上述条件下，每分钟光密度值增加0．01时，所需酶量定为1个BANA单位
在上述胰蛋白酶抑制物提取的条件下，所定的抑制单位。也可以根据提取液的体积，换算成每克或每毫克样品中，所含胰蛋白酶抑制单位数。