病理学检查
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《禽病手册》第39页（18276字）
一、病理解剖学诊断
病理剖检诊断是通过尸体剖检、观察病理变化以达到诊断疾病的目的。家禽周身被披羽毛，不能像其他动物一样能从体表的变化获取大量与疾病诊断有关的信息，必须对病禽进行剖检，必要时采集组织器官样品进行病理组织学检查才能很好地做出诊断。
患任何疾病的病禽的组织器官都可能产生各种病理形态学变化。有些形态学的变化具有特征性，如当发现病鸡腺胃乳头出血时，我们首先联想到的鸡病是新城疫，而当剖检发现法氏囊严重出血时，首先想到的是鸡传染性法氏囊病，我们就是根据这些病理形态学变化，来分析病因，诊断疾病的。
(一)常用器械和药品
常用的剖检器具有手术剪、普通剪、解剖刀、消毒注射器、针头、玻璃瓶、培养皿、镊子、酒精灯、乳胶手套等。根据需要，可以准备一些用以收集血样和组织标本的器材。
常用的药品有酒精、福尔马林、消毒剂(如新洁尔灭)等。
(二)宰杀家禽的方法
宰杀家禽有多种不同的方法，各有各的优点。选择宰杀家禽方法的标准是要在瞬间处死禽类，而不使其在这一过程中感到过多的痛苦。另外，还应考虑不同禽病的特点和病料采集的要求。
1．断颈法 断颈法是杀死雏禽的最快方法。具体是一手在后提起双翅，另一手掐住头部，在将头部急剧折向垂直位置的同时，快速用力向前拉扯。这样，可在一瞬间折断颈部和脊髓。紧紧地抓住双翅可以防止鸡扑打、掀起尘土。如能掐紧头部直至挣扎停止，就可防止濒死时嗉囊内容物反流而吸入呼吸道。
对于年幼的雏鸡，也可在桌子的锐缘紧压，这样很容易将颈部折断。用大拇指和食指紧捏或用外科剪没有刀刃的内角作为小钳子紧夹也有同样的效果。
牛阉割钳可用于处死大鸡和火鸡。一个人既拿鸡又要同时进行操作是较困难的，但若有一个助手进行帮忙，操作起来就相当自如了。如钳子在反射性肌肉痉挛停止前一直保持夹住状态的话，这项技术还能防止濒死期反胃和嗉囊内容物反流而吸入呼吸道。
2．电击法 电击法宰杀家禽是一种令人满意的方法。把连接电线的钳子固定在泄殖腔和嘴上(这样可以保持湿润接触)，然后电线用标准插头直接连接110伏交流电插座。打开开关使电线通电。
采用这一系统鸡很少挣扎，因而不会造成尘土飞扬或嗉囊内容物反流。同时发生濒死性出血的危险也较小，当需要组织标本时也不会发生血液溢出的现象。但必须防止对人员的危险和金属桌面出现的短路。
3．空气致死法 将注射器内吸入至少3～4毫升的空气，将针头作心脏穿刺，并向心脏内注射空气，病禽可在瞬间死亡。本法优点是简便、快速，不会对脏器造成人为的损伤而影响剖检观察。
4．放血法 放血法是经动脉放血致死的一种方法，有颈动脉放血法和腭动脉放血法两种。
颈动脉放血是将颈部皮肤剪开，找到颈动脉，然后剪断，将家禽倒提，直至禽死亡。优点是血液不污染呼吸道，适用于各种日龄的家禽。
腭动脉放血将双翅及腿绑定，并捏住头，用剪刀撬开口腔，在上腭的后部剪断腭动脉，优点是干净，适用于各日龄的家禽，但易于污染呼吸道，不适于呼吸道疾病的诊断。
(三)尸体剖检的注意事项
1．剖检场地选择 剖检场地最好在通风良好、光线充足的室内进行，也可选在远离禽舍，易于清理和消毒的室外进行。切忌因剖检将场地污染，而造成周围环境的污染，或成为疫病的传染源。
2．剖检人员防护 如果有理由怀疑待剖检的患禽已感染了疾病，而感染的疾病可能对人有接触传染性(如鸟疫、丹毒)，必须采取严格的卫生措施。应当用消毒药将尸体和剖检台面完全浸湿。应带上优质橡皮手套和口罩，操作中还要谨慎从事，避免皮肤刺伤，也不能吸入组织或粪便形成的尘埃或气溶胶。因此最好戴上细粒面具，以防吸入污染的尘埃。所有可能与尸体、组织或培养物发生接触的实验室人员，必须了解它们可能的传染性和相应的预防措施。
3．剖检对象的选择 待剖检的家禽最好是濒死的或死后不久的家禽(一般不应超过6小时，夏季不应超过4小时)。应从发病禽群中选择带有典型症状的家禽剖检，而不能选择一些慢性病的家禽。
(四)剖检技术
标本背位仰卧，依次将两条腿拉开，远离身体，在腿腹之间切开皮肤。然后紧握大腿股骨处，向前、向下、再向外折去，直至股骨头和髋臼完全分离，两腿便可平放在台上。
沿中线先把胸骨嵴和肛门间的皮肤剪开，然后向前，如果必要的话，直至身体的整个腹面，连同颈部整个暴露出来。如有肌肉出血，此时即可观察到。
暴露内脏的方法有两种。一种是用剖检刀或剪刀在肛门和胸骨之间横切／剪腹壁，然后切开两侧胸脯肌肉。再用骨钳切断肋骨骨架，随后切断两侧的喙突和锁骨。要仔细操作，不要弄断气管或大血管；另一种次序相反的做法也很好，即先切断锁骨和喙突，然后，切开两侧的肋骨骨架和腹壁。此时便可把胸骨及附属结构从尸体上移走，放在一侧。上述两种方法均可使所有内脏器官充分暴露。
若事先尚未采集血样，且被检禽只刚好是在剖检前杀死的，则可在血液凝固之前用心脏穿刺采血。也可切开通向腿部的大静脉，使血液聚集在一定区域，随后收集。
(五)脏器病变的检查
脏器检查顺序可按流行病学和临床症状提示的线索进行。如腹泻应先检查消化道，呼吸道症状应先检查呼吸系统，然后进行全面系统地检查。
1．消化系统检查 食道、嗉囊：管腔黏膜性状，嗉囊内容物性状，有无异味。
腺胃：首先检查腺胃的大小、硬度，然后剪开胃壁观察内容物和黏膜状况、着重观察黏膜有无出血和溃疡、黏膜乳头大小及是否肿胀、是否有寄生虫、腺胃壁的厚度等。如发现腺胃黏膜出血，应首先怀疑新城疫；如乳头大小不一，且有溃疡，而腺胃壁肥厚，则可疑为马立克氏病或传染性腺胃炎(腺胃型传染性支气管炎)。
肌胃：应观察外表有无肿瘤样物，然后切开胃壁，观察角质膜有无溃疡，剥下角质膜后，肌胃黏膜的状态便显露出来，看是否有出血或溃疡。
小肠：小肠包括十二指肠、空肠和回肠。先从浆膜面观察有无渗出物，肠壁有无增生性病灶，如肿瘤或坏死灶(马立克氏病，大肠杆菌肉芽肿、结核结节等)，肠内有无出血点或出血斑，或白色小点。然后逐步剪开肠管，仔细观察内容物数量、颜色，有无寄生虫(如蛔虫、绦虫)，重点是肠黏膜的状况。如怀疑是新城疫，应着重观察十二指肠上段、中部和卵黄蒂后3厘米处、回肠中部等处，可发现枣核形的黏膜潮红、肿胀出血或溃疡。如肠黏膜弥漫性出血，则首先应怀疑小肠球虫病，此时最好取载玻片涂片镜检。如小肠有大面积溃疡，则应怀疑是否有溃疡性肠炎。有时黏膜面被覆纤维素样渗出物。
肠壁的增厚或变薄，也提示了家禽生前有肠炎的可能。
盲肠：应观察盲肠的粗细、硬度等。如果内有白色盲肠芯，横切时见到树轮样结构，黏膜也有坏死，这是鸡盲肠肝炎的特征；鸡白痢时盲肠虽也变粗，内容物也呈白色，但横切没有盲肠肝炎时的特征；黏膜大面积溃疡，则提示有溃疡性肠炎的可能。盲肠扁桃体常有充血、出血和溃疡，新城疫等病常出现这样的病变。
直肠：直肠的变化不很复杂，有时可见到肠黏膜有针尖大的出血点，肠内容物有时呈白色石灰乳状。
肝脏检查：肝脏的变化非常复杂，有很多疾病可以引起肝脏的各种变化。首先应检查肝脏的形状、大小、色泽、被膜性状等，若体积肿大表明有传染病或中毒病，色泽加深是淤血的表现，色变淡或呈土黄色，则提示发生了变性。包膜发炎很可能是大肠杆菌病的变化。其次应检查肝脏表面有无出血点、坏死灶、结节或有无破裂等，很多鸡病可出现肝脏出血，如中毒、鸡白痢、弯曲杆菌性肝炎、包涵体肝炎、住白细胞原虫病等；肝脏坏死见于鸡白痢、副伤寒、鸡霍乱、大肠杆菌病、盲肠肝炎、鸡结核等；而结节性病变常见于马立克氏病和淋巴细胞性白血病。肝脏破裂可见到腹腔内有血液，肝脏表面有血凝块，提示肝脏发生严重的脂肪变性或脂肪肝。最后检查肝脏质地、切面等情况，变性时肝质地变脆、易碎，在脂变时有油腻感；切面如隆突，表明肝肿大；肝质地变硬时则有肝硬变，提示慢性中毒。同时注意肝淋巴结、血管、胆囊、胆管的性状。
脾脏检查：先检查脾脏的大小、硬度、色泽，急性炎症、坏死或有肿瘤时，脾脏肿大。通常色泽暗红时，说明脾脏淤血，常见于鸡伤寒。再检查脾脏有无坏死灶、出血点、肿瘤病灶，结核病时有较大的坏死灶；脾出血常见于住白虫病；如脾脏有肿瘤，主要见于马立克氏病和淋巴细胞性白血病。最后切开脾脏，观察切面情况，如切面隆突边缘外翻，也表明脾脏肿大。
胰脏检查：首先检查胰腺色泽、质地，色泽变灰白，且质脆易碎，则表明胰坏死，常发生于硒－VE缺乏症；出血多见于住白细胞原虫病；而肿瘤病，则可见有肿瘤形成。
2．呼吸系统检查 咽喉、鼻腔、眶下窦、气管检查：重点检查黏膜色泽，局部淋巴结性状，有无出血，炎症，眶下窦内有无炎性渗出物和分泌物。
肺脏检查：首先检查肺脏的颜色、质度、弹性及肺淋巴结。肺脏正常为粉红色，如有淤血或呈暗红色，特别是自然死亡鸡，色泽一般暗红。肺正常时质地软、弹性好，用手触摸各肺叶，有无硬块、结节和气肿。若质地发生变化，弹性差，提示有水肿的可能。其次检查肺脏有无病灶及出血，若肺脏有灰白色半透明病灶，病灶质地硬，则可能有鸡白痢或马立克氏病；肺脏和气囊有同样病变时，可能由真菌引起。有时肺脏可发生出血，则可疑住白细胞原虫病，此时再查肾脏和其他组织器官。切开气管、支气管，检查黏膜有无出血、渗出物。最后横向切开肺叶，观察有无结节、寄生虫、血液及水肿液流出。有时可见支气管壁肥厚，管腔内有渗出物，可疑支气管炎、喉气管炎、黏膜型鸡痘及支原体病等。还要注意支气管间质的变化。
气囊检查：气囊是禽特有的呼吸器官，正常时是无色、透明而光滑的薄膜。有炎症时，气囊增厚，浑浊、不透明，其表面覆有渗出物，可疑支原体病、大肠杆菌病及支气管炎或这些疾病混合感染。气囊表面有黄白色、黄绿色结节，可考虑是否为真菌所引起的，应查看肺脏及其他浆膜。
3．心及心包检查 首先观察心包液，心包有无异物附着。正常心包腔内有少量液体起润滑作用，这些液体是透明无色的，若量增多，颜色异常或变混浊，有纤维素样物附着，应考虑纤维性心包炎，可怀疑大肠杆菌、支原体等引起的病变。其次检查心外膜有无出血点及心肌的硬度、颜色及心脏形状。心外膜的出血多见于心冠脂肪，出血点有大有小，多见于一些急性新城疫、急性霍乱、禽流感等。心脏由正常的圆锥状变成钝圆，表明心脏变形，提示有心力衰竭，常见于腹水症等。
再次检查心肌表面有无白色隆起，检查时应注意区别心尖上的脂肪，脂肪有特殊光泽，且较软，而白色隆起质度硬，有的深达心肌内部，可怀疑鸡白痢结节和肿瘤。而米粒大的小白点可能是住白细胞原虫引起的。检查心内膜色泽，有无出血；瓣膜是否肥厚，有无缺损；腱索粗细、有无断裂。
4．泌尿生殖系统检查 肾脏检查：能引起肾脏变化的鸡病很多，且大部分死亡的鸡都与肾功能衰竭有关。首先检查肾脏体积、颜色，肿瘤病和很多传染病可引起肾脏肿大，而当输尿管阻塞时，部分肾脏可萎缩；肾小管内有白色结晶时，是由于尿酸盐沉着引起的，常见于痛风、维生素A缺乏症、肾型传染性支气管炎、传染性法氏囊病、鸡白痢、大肠杆菌病及某些中毒病；若肾脏红肿，可能由于伤寒引起。再检查肾脏有无出血，肾出血主要见于住白细胞原虫病，肾脏淤血可能为禽流感。
输尿管检查：有时输尿管显着增粗，内含大量白色尿酸盐或结石，常见于痛风或尿石症。
卵巢检查：首先观察卵巢发育程度。发育正常的鸡，卵巢发育与体积发育同步，如体积小，提示营养不良。其实观察卵巢形状、颜色、硬度、有无出血及水肿情况，如卵泡由圆形变成鼓槌状或其他形状，则可能由沙门氏菌引起；若由橙黄色变为灰白、土黄、绿色等，提示有白痢的可能；若卵巢变硬，状似菜花，则可能是肿瘤；新城疫、鸡霍乱及白痢等可引起卵泡出血、破裂等病变；有时卵巢可形成半透明样水肿。
输卵管检查：在发育过程中，右侧发生退化，左侧保留。检查时应首先观察输卵管粗细、颜色及硬度。正常时输卵管粗细适中，呈灰白色，且较软。如输卵管增粗，或粗细不匀，色呈黄色，质地变硬，则为输卵管炎，可能由大肠杆菌等细菌引起；若粗细不均，且有透明囊泡，则可能由传染性支气管炎引起。其次检查卵管内有无渗出物及输卵管黏膜的状态，在各种传染病中，输卵管内都可能有不同的内容物，有的像熟卵状，有的腐败；而黏膜有时发生水肿，此时应怀疑有无减蛋综合征。有时输卵管可形成肿瘤。
睾丸检查：主要检查其大小、硬度、颜色，如睾丸变小或达不到正常体积，则可能是营养不良，或由传染性鼻炎引起，有时肿大，硬度增加，则可能为肿瘤，多见于马立克氏病和淋巴性白血病。
5．外周神经检查 在大腿内侧，剥离内收肌，即可显露坐骨神经；在脊柱的两侧，仔细剔除肾脏，即可暴露腰荐神经丛，对比观察两侧神经的粗细、色彩、横纹消失情况，如神经明显肿胀，通常横纹也消失，而且有光亮感(水肿)，常见于马立克氏病及维生素缺乏症等。
6．法氏囊检查 法氏囊(bursa Fabricii)又称腔上囊，为禽类所特有，位于泄殖腔的背侧，开口于肛道。鸡的呈球形(或长椭圆形)，鸭鹅为长椭圆形，性成熟前达最大，性成熟后开始退化直至完全消失。法氏囊的主要功能与体液免疫有关，是产生B淋巴细胞的初级淋巴器官。
首先观察法氏囊周围组织有无水肿、法氏囊体积。若体积增大，则可能由喹乙醇中毒、淋巴细胞性白血病引起，如法氏囊体积缩小，应考虑营养不良、马立克氏病或传染性法氏囊病的后期。其次切开法氏囊观察其黏膜面有无出血、坏死或肿瘤及溃疡，黏膜出血或坏死，提示有传染性法氏囊病的可能，但住白细胞原虫病也可引起出血；黏膜皱褶肿胀或有溃疡，可能是淋巴细胞性白血病，发生法氏囊袋状肿大时，可能因为药物等中毒引起。
二、病理组织学诊断技术
病理组织学诊断技术是疾病诊断的重要手段，它通过对病变组织形态结构的观察，研究疾病发生、发展和转归的一般规律，为阐明疾病的本质提供科学依据，同时为疾病的治疗和预防提供理论基础。
(一)病料的采集
病料的采集应注意以下几个方面：
(1)取材要全面，有代表性。在一块病料中，要包括病变组织和周围的正常组织以便于比较；
(2)切取组织用的刀剪要锐利，尽可能不使组织受到挤压等人为损伤。胃肠、胆囊等组织剪取后直接放入固定液中，不要用水冲洗。组织块大小一般为长、宽1～1．5厘米，厚度0．4～0．5厘米。取料后立即放入10倍于组织块体积的10%福尔马林或其他固定液中；
(3)病料要新鲜，以防死后组织自溶影响其形态。最好在病鸡濒死前将鸡处死，立即取材并迅速放入固定液中。
若现场无甲醛，可暂时用60°左右的高度白酒浸泡病料，然后到实验室及时更换固定液。
(二)病料固定
将采集的病料浸入防腐剂即固定液中，使细胞内的物质变为不溶性，尽可能使组织保持原有形态结构以利保存和制片，这一过程称为固定。
1．固定的目的 固定的目的可以概况为以下几点：(1)防止组织自溶和由于细菌繁殖引起的组织腐败；(2)使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀或凝固下来，使组织尽可能保持生活时的形态结构；(3)固定可使柔软组织硬化，不易变形，有利于保存和制片，某些固定剂有助染作用，可使细胞易于着色。
2．固定液的配制和使用 固定液可分为简单固定液和混合固定液两大类。简单固定液(又称单纯固定液)是使用一种化学试剂的固定液，如乙醇、甲醛、冰醋酸等。这些简单固定液往往对细胞的某些成分固定效果好，而对另一些固定成分效果不好，因此都有局限性。混合固定液是用几种化学试剂按一定比例配制而成，由于不同试剂优缺点互补，因此可产生较好的固定效果。
乙醇：乙醇是一种还原剂，不能与铬酸、重铬酸钾或锇酸等氧化剂配制混合固定液。乙醇穿透组织的能力很强，但经乙醇固定后，组织收缩显着，表面变硬，从而阻止乙醇渗入到组织深部。所以乙醇不适用于固定大块组织。为避免组织过度收缩，可选用80%乙醇固定数小时后，再转入95%乙醇中，由于50%以上的乙醇能溶解脂肪、类脂体和血色素，并能破坏其他多种色素，所以作脂肪、类脂体和色素检查时不能用乙醇作固定液。乙醇能沉淀核蛋白和肝糖原，但沉淀物易溶于水，所以乙醇固定的标本核染色不良。肝糖原制片的标本不能投入50%以下的乙醇中。
乙醇既有固定作用，又有脱水作用。80%、70%乙醇可作为保存剂长期保存组织。经其他固定液固定的组织可保存在70%乙醇中，若长期贮存宜加入少量甘油。如果检查尿酸盐结晶和保存糖类，则用100%乙醇固定。
甲醛：甲醛也是一种还原剂，具有强烈刺激气味，易挥发且溶于水。市售37%～40%甲醛溶液称为福尔马林(Formalin)。固定组织和保存标本常用10%福尔马林，即1份福尔马林加9份蒸馏水，甲醛含量实际仅为4%。
福尔马林穿透力强，固定均匀，并能增加组织的韧性，小的组织块(1．5厘米×1．5厘米×0．2厘米)数小时即可固定完全。快速固定可加温到70～80℃，10分钟即可完成固定。短时固定标本可不经水洗直接投入乙醇中脱水，但经长期固定的标本要水洗1～2天，否则会影响染色效果。肝、脾等多血组织经长期固定后会产生黑色素或棕色素的沉淀，欲除去这些色素沉淀，切片可于脱蜡后浸入0．5%氨水乙醇溶液(浓氨水1毫升加75%乙醇200毫升)30分钟，再用流水冲洗后进行染色。若色素沉淀仍未被洗去，则可延长在0．5%氨水乙醇溶液中的时间。
经福尔马林固定后组织的糖类和尿酸盐结晶可被溶解，但细胞核着色甚佳。
醋酸：醋酸又称乙酸，因其纯品在16．7℃以下形成冰状结晶，所以又称冰醋酸。固定常用5%醋酸水溶液。醋酸不能沉淀白蛋白、球蛋白，但能沉淀核蛋白，因此对染色质或染色体的固定与染色效果很好。醋酸穿透力强，一般大小的组织只需固定1小时即可。醋酸不沉淀细胞质的蛋白质，所以不会使固定的组织硬化，并可抵消乙醇固定所引起的组织高度收缩和硬化。因此，醋酸常与乙醇配成混合固定液。醋酸固定后的组织不必水洗，可直接投入50%或70%乙醇中。
苦味酸：用作固定液的是苦味酸的饱和水溶液。苦味酸能沉淀一切蛋白质，穿透力中等，能使组织显着收缩，故一般不单独使用。组织经苦味酸固定后被染成黄色，可用70%乙醇洗去，残留的少量黄色不影响染色，如欲除去可在70%乙醇中加入少许碳酸锂饱和水溶液或氨水。
以下介绍几种常用的混合固定液。
Bouin氏液：苦味酸饱和水溶液 75份
40%甲醛 25份
冰醋酸 5份
Bouin氏液穿透力强，组织收缩小而且不会变硬、变脆。小组织块只需固定数小时，一般动物组织固定12～24小时。固定后的组织经水洗12小时即可投入乙醇中脱水。组织中残留的少量苦味酸并不影响染色。
Carnoy氏液：无水乙醇 6份
冰醋酸 1份
氯仿 3份
Carnoy氏液中的无水乙醇可固定细胞质，冰醋酸则固定染色质，同时可防止由乙醇所引起的组织的高度硬化和收缩。此液穿透力强，小组织块只需固定1～2小时，且不需水洗可直接投入95%乙醇中脱水。Carnoy氏液适用于DNA的固定。
(三)脱水、透明、浸蜡和包埋
1．脱水 经过固定和水洗的组织含大量水分，而水与石蜡是不能互溶的，所以在浸蜡、包埋前必须将组织中的水分脱去。常用的脱水剂是乙醇。组织在脱水前应修成长、宽为1．8厘米、厚度为0．2～0．3厘米的小块，然后依次进入70%、80%、95%至100%乙醇的脱水程序。脱水的基本过程为：
70%乙醇 0．5小时 95%乙醇 2～4小时
80%乙醇 2～4小时 100%乙醇 2～4小时
95%乙醇 2～4小时 100%乙醇 2～4小时
如将各组乙醇放入温箱中加温，每步脱水时间均可缩短为30～45分钟。脱水时间应根据组织种类和体积大小的不同灵活掌握。致密或大块的组织则应延长脱水时间，脂肪组织或疏松的纤维组织也应延长时间，特别是在95%乙醇中。只有脱净水分、溶去脂肪，石蜡才能渗入脂肪细胞和纤维组织中去。如脱水不尽，二甲苯则不能浸入组织，石蜡就不可能很好地渗到组织中去，也就不可能做出高质量的切片。
如需做糖原和尿酸盐结晶染色的切片标本，组织经无水乙醇固定后，不经过水洗和低浓度乙醇脱水的过程，只需更换一次无水乙醇进行脱水即可。
2．透明 由于乙醇与石蜡不能互溶，组织在脱水后，浸蜡前经过一个既与乙醇互溶又与石蜡互溶的媒剂，以便石蜡浸到组织中去。由于组织经媒剂作用后显示透明状态，因此习惯上将这一过程称为透明。
二甲苯是常用的透明剂，但其对组织收缩性强，易使组织变脆，所以组织在二甲苯中的时间不宜过长，一般以组织透明为度。实际操作中一般两次更换二甲苯，有时甚至三次，每次时间为10～15分钟。次数的多少，时间的长短应视具体情况而定。
3．浸蜡 经媒剂透明的组织在熔化的石蜡中浸渍，称为浸蜡。浸蜡过程是石蜡渗入组织取代二甲苯的过程。这一过程中一般应三次更换石蜡。第一步常用加入少量二甲苯或低熔点石蜡，第二步使用熔点较高的硬蜡，第三步可直接用包埋石蜡浸渍。整个浸蜡过程一般需要3小时左右。浸蜡时间要视组织的种类、大小的不同和温度的高低而定。时间过长会使组织脆硬，切片破碎，过短则浸蜡不足，难以做出高质量的切片。
浸蜡用的石蜡，其熔点一般要求在52～56℃，应用时根据气候和室温进行选择，夏天宜采用高熔点石蜡，冬天则要用低熔点石蜡。
4．包埋 将经过固定、脱水、透明和浸蜡的组织用石蜡或火棉胶包埋起来，使组织获得一定的硬度和韧度以便于切片，这一过程称为包埋。病理诊断最常用的是石蜡包埋法，现介绍如下：
将熔化的石蜡倾入高约1～1．5厘米的组织包埋金属框或叠好的纸筐内，将浸蜡的组织块用经过加温的镊子迅速放入包埋框或纸筐的石蜡中，组织块切面朝下，放平放正。待石蜡凝固后，将包埋框或纸筐打开，除组织周围留下少许石蜡外，组织外周多余的石蜡用刀片切除。包有组织的石蜡块最好修切成方形，以便切片时形成蜡带。
石蜡包埋应注意以下两点：(1)包埋蜡和镊子温度不能过高，否则会烫坏组织，影响诊断。(2)包埋蜡的温度应与组织块的温度相同，否则会造成组织块与周围石蜡脱裂。
包埋蜡的熔点一般要求在56℃左右，炎热季节应选用熔点较高的石蜡，寒冷季节则宜选用低熔点石蜡。硬组织最好用较高熔点石蜡，柔软的组织则应选用低熔点石蜡。
(四)切片
1．切片过程
(1)切片：切片之前先将经过切修的蜡块粘到大小适中的方形木块(台木)上。将蜡块的底部加热至表层石蜡熔化，然后迅速将蜡块粘到经过加热的台木上，在蜡块的四周略烫一下，将蜡块粘牢后安装到切片机上。
石蜡切片常用的切片机为转轮切片机，当然，也可以使用滑走式切片机。转轮切片机每转一圈切下一张薄片。一般病理切片要求切片厚度为4～6微米，石蜡切片可以切到2微米甚至1微米。
在正式切片之前，先将蜡块用切片机修齐、修平，直到组织全部暴露于切面时，再将调节器调至需要的厚度正式切片。切片时要用力均匀，使切下的切片完整而且能连成带状。
(2)展片和贴片：用干燥毛笔将切片从切片刀上取下放入约37℃的温水中，光亮面向下平摊于水面之上。用镊子将切片上的皱褶细心地张开，然后将水温升高至45℃左右，切片则因水温升高展平在水面上。用镊子或解剖针将每张切片分开，取完整而无皱褶的切片贴附于经过处理的载玻片上，方向要摆正，最好放于载玻片中间偏左的位置上，以便右边贴标签。
(3)烤片：烤片的目的是将切片与载玻片之间的水分除去。烤片的温度一般不超过60℃，可将载玻片放入烤片台上烤干；也可将载片放入载片盒中，然后将载片盒打开，竖放或斜放入温度适宜的温箱中烤干。烤片的时间一般为24～48小时，时间过短染色时易出现脱片。
2．切片过程中应注意的事项
(1)切片方面：首先切片刀要锋利，刀口无损，切片才能完整。如果切片刀有缺口，切片会出现断裂、破碎和不完整。如果刀口太钝，切片会自动卷起来或皱褶，也不能形成连续的带状。切片刀的倾角以20～30°为宜，过大则切片上卷不能成带，过小则切片皱起。切片机的各个零件和螺丝要旋紧，否则会产生震动，影响切片质量。切片时应用力均匀，切过度硬化的组织更应如此，以防止由于震动形成空洞。
切片前最好将切片刀和蜡块冷冻，这样可增加石蜡硬度、减少切片的皱褶，这在夏季和秋季切片时尤为重要。
(2)载玻片的处理：病理组织学诊断使用的载玻片应先用洗衣粉洗净，再放入95%或无水乙醇中浸泡，使用前用真丝绸布擦干。为使切片与载玻片粘贴牢固，常使用蛋白甘油作粘贴剂。取新鲜蛋清，用竹筷等打成液状，经纱布滤到量杯中，加等量甘油与之混匀，再加少量麝香草酚或石炭酸防腐即成。载玻片黏附切片前，先用手指涂布一层蛋白甘油，蛋白甘油应薄而均匀，太厚则影响切片的染色。蛋白甘油一般4℃保存，每隔1～2个月重配一次。
(五)染色
通常将切片的染色方法分为两种：一种是普通染色法，即常用的苏木素－伊红染色法，简称H．E染色法；另一种称为特殊染色法，例如脂肪染色法、糖原染色法、黏液染色法等。
1．苏木素－伊红染色法(H．E染色法)
(1)H．E染色基本过程 石蜡切片的H．E染色法包括脱蜡、染色以及脱水、透明、封固等过程，现简述如下：
①脱蜡 脱蜡的顺序如下。
二甲苯Ⅰ 2～5分钟 85%乙醇 2分钟
二甲苯Ⅱ 2～5分钟 75%乙醇 2分钟
无水乙醇 2分钟 蒸馏水 2分钟
95%乙醇 2分钟
②染色
苏木素染液 10～20分钟
自来水 2分钟
1%盐酸乙醇 3～5秒钟
自来水 数分钟至数小时
碳酸锂饱和水溶液 片刻
自来水 15分钟
蒸馏水 2分钟
0．5%～1%伊红溶液 1～2分钟
③脱水、透明、水洗
95%乙醇Ⅰ 2分钟
95%乙醇Ⅱ 2分钟
无水乙醇Ⅰ 2分钟
无水乙醇Ⅱ 2分钟
二甲苯Ⅰ 2分钟
二甲苯Ⅱ 2分钟
④封固 取适量光学树脂于组织片上，将经过清洗的盖玻片覆于组织片上并摆正位置。将制好的切片置温箱中干燥或阴干，在切片的右端贴上标签，注明动物及组织名称、染色方法、日期等。
(2)H．E染色常用染液配制
①Ehrlich氏酸性苏木素染液
苏木素 2克 蒸馏水 100毫升
无水乙醇 100毫升 冰醋酸 10毫升
甘油 100毫升 钾明矾 过量(约15克)
将苏木素溶于无水乙醇，然后加蒸馏水、甘油和冰醋酸，最后加入钾明矾，边加边搅拌，直到瓶底出现钾明矾结晶沉淀为止。混合后的溶液呈淡红色，用纱布封住瓶口，在日光下使其自然成熟，时间大约要三个月。成熟后溶液的颜色为深红色。Ehrlich氏苏木素染液贮存愈久染色愈强，染色时间为5～20分钟，每次用时需过滤，但用久后仍需过滤。
②1%盐酸乙醇
70%乙醇 99毫升
浓盐酸 1毫升
③0．5%～1%伊红(曙红)溶液
(a)0．5%～1%伊红水溶液
伊红 0．5～1克
蒸馏水 100毫升
(b)0．5%～1%伊红乙醇溶液
伊红 0．1～1克
95%乙醇 100毫升
(3)H．E染色注意事项
①脱蜡 脱蜡用的二甲苯应经常过滤并且定期更换。当切片浸入二甲苯后发现有白色云雾状态存在，说明切片尚未充分干燥，应立即取出并继续干燥。当切片浸入水中如有白雾状态出现，说明清洗二甲苯用的乙醇浓度不够或使用过久，应将切片返回95%乙醇中做较长时间处理，云雾现象即可消失。这种情况下乙醇应降级使用，用到一定时间则必须更换新液。
二甲苯脱蜡的时间受环境温度的影响，夏季1～2分钟就可以了，冬天则应延长，有时还需要加温。脱蜡时间长一些无妨碍，而脱蜡不干净会影响染色。
②染色 苏木素染色时间应视组织的不同、染色液的新旧、气候的冷暖而有所不同，可着染一定时间后(10分钟左右)取出镜检，如染色不足再延长时间。如环境温度太低，可将苏木素染液放入25℃左右的温箱中染色。
苏木素染液使用一段时间后表面会出现一些漂浮物，必须过滤除去，否则会沉于组织上很难去掉。苏木素染过300～400片后着色力减弱，应更换新液。
盐酸乙醇的“分化”是苏木素染色的关键。分化的目的是使组织中不应着染苏木素的部分的色彩清晰、适度。切片在盐酸乙醇中脱色速度很快，放置时间稍久颜色可全部脱尽，因此必须掌握好分化的时间。分化不够则细胞呈黑团状，伊红复染后组织呈紫蓝色。切片经适度分化后应立即投入自来水中洗去酸液，中止脱色。
将切片投入碳酸锂饱和水溶液中的目的是使细胞核等着染苏木素的细胞成分变蓝，这一过程称为“蓝化”或“反蓝”。蓝化时间片刻即可(20秒钟左右)，时间过长会造成组织块脱落。切片经蓝化后应充分水洗，除去碱性溶液，否则会影响伊红着色，切片染成后的颜色也不易保持。碳酸锂饱和水溶液可用氢氧化氨代替(浓氨水1毫升加入99毫升蒸馏水中)。
伊红复染宜淡不宜深，着染过深会使胞核不清晰。但有时伊红不易着染，或复染后乙醇脱水的同时把红色脱掉。遇到这种情况可在伊红染液中加入数滴冰醋酸助染，或在后面脱水的乙醇中加入少量伊红以防止脱色。
③脱水、透明 脱水用的乙醇和透明用的二甲苯使用时间过久或有水分混入时应更换新液，或将高浓度溶液降级使用。脱水不彻底会使切片从乙醇移入二甲苯后产生白色云雾，切片呈模糊、不透明状态，更换新液后这种现象即可消除。
④封固 封固用树脂的浓度过稀则易溢出玻片，过浓则不易扩散，如有气泡产生也不易除去，因此必须适当。滴加树脂时不宜过多，以免封盖时溢出，同时也不可过少，以免封盖不全影响切片的保存。封盖时要轻，以免产生气泡。
2．常用特殊染色法
(1)脂肪染色法：脂肪不溶于水但极易溶于乙醇。石蜡切片在H．E染色过程中，切片乙醇脱水的同时，脂肪也被乙醇溶去，只留下大小不同的空泡。只有用冰冻切片方法才能将脂肪或类脂质保存下来，再用油溶性染料染色显示脂肪。
脂肪染色法有苏丹Ⅲ染色法、苏丹Ⅳ染色法和苏丹黑染色法等，这里只介绍苏丹Ⅲ染色法和苏丹黑杂色法。
①苏丹Ⅲ(SudanⅢ)染色法
固定：10%福尔马林
切片：冰冻切片，漂浮法染色
(a)将冰冻切片以蒸馏水洗后，于明矾苏木素染液中浸染0．5～1分钟。细胞核宜淡染。
(b)于自来水中冲洗蓝化。如核染色过深，可用1%盐酸乙醇分化，分化后应迅速水洗。
(c)水洗后移入70%乙醇中5秒钟。
(d)移入苏丹Ⅲ染液中30分钟或更长，着染苏丹Ⅲ应在56℃温箱中进行。
(e)在70%乙醇中分化洗涤5～10分钟。
(f)将切片漂浮于蒸馏水中，然后移入载玻片上，稍吸水使潮干。
(g)切片以甘油明胶封固。
苏丹Ⅲ染液
苏丹Ⅲ 0．15克
70%乙醇(或与丙酮的等量混合液) 100毫升
临用前过滤，滤液为苏丹Ⅲ饱和液。浸染时容器必须盖好，否则会因乙醇或丙酮挥发使染料沉淀。
甘油明胶
白明胶 15克 甘油 105毫升
蒸馏水 90毫升 酚结晶 0．5克
稍加热使白明胶溶于蒸馏水中，溶解后加入甘油和酚结晶，搅拌至混合均匀为止。趁热用玻璃棉过滤，贮存备用。
苏丹Ⅲ染色结果：脂肪呈橙红色，胆脂素呈淡红色，脂肪酸不着色，胞核呈蓝色。
②苏丹黑染色法
固定：10%福尔马林
切片：冰冻切片，漂浮法染色
(a)将冰冻切片经蒸馏水洗，投入Mayer氏明矾卡红或1%中性红中，胞核染色1～3分钟。
(b)蒸馏水洗后投入苏丹黑染液中浸染20～30分钟。
(c)70%乙醇中分化。
(d)蒸馏水洗，并将切片移于载玻片上。
(e)甘油明胶封固。
苏丹黑染液
苏丹黑 1克
70%乙醇 100毫升
Mayer氏卡红溶液
卡红 2．0克
5%胺明矾水溶液 100毫升
将卡红溶于5%胺明矾水中煮沸1小时，然后加至原量100毫升，加少许麝香草酚做防腐剂。
苏丹黑染色结果：脂肪呈黑色，胞核呈红色。
(2)尿酸盐结晶染色法：尿酸盐不溶于无水乙醇但溶于水，所以固定前不能水洗，染色过程中也应尽可能缩短与水接触的时间以免尿酸盐溶解。
固定：用如下固定液固定6小时
黄醇 6克
冰醋酸 100毫升
之后再用无水乙醇固定兼脱水48小时(可2～3次更换无水乙醇)
切片：石蜡切片
(a)切片烤干、脱蜡。
(b)明矾苏木素浸染2分钟。
(c)水洗。
(d)无水乙醇脱水、二甲苯透明。
(e)封固。
尿酸盐染色结果：尿酸盐结晶呈辐射状，颜色为深蓝色或黄绿色。苏木素染后可用伊红复染，结果为紫红色或棕色。
(本部分作者为尹燕博、崔尚金)