肿瘤病毒亚科
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第708页（4921字）
本亚科分为三个属，即C型、B型和D型肿瘤病毒属。后两属目前在兽医中尚未发现有严重的致病性，本书不作介绍。
一、禽肉瘤和白血病病毒群(Avian sarcoma and leukemia viruses)
本群病毒可使鸡发生多种肿瘤性疾病，故又称为禽白血病综合征病毒。最常见的疾病是禽肉瘤(劳斯肉瘤，Rous sarcoma)和淋巴细胞增生病，较少见的有成红细胞增生病、成髓细胞增生病、骨髓细胞瘤、肾真性瘤和骨化石病等。
病毒通过垂直或水平传播，一般感染鸡在短暂的病毒血症后，出现免疫学应答，但中和抗体不能阻止该病毒的增殖。
(一)样品采集 分离病毒的最好材料是病鸡的全血和血浆(用枸橼酸钠抗凝，不要用肝素)、卵蛋白、鸡胚和肿瘤组织。有时也用粪便，但须加青霉素、链霉素和二性霉素B。
(二)病毒分离
1．细胞培养
(1)用无病毒的鸡胚制备继代成纤维细胞。
(2)用可能含病毒的样品接种，置35～37℃培养。
(3)如接种后4～5天用显微镜看到转化细胞灶(细胞集落)，10天后用肉眼看到，可认为样品中含有禽肉瘤病毒。
2．鸡胚接种
(1)将样品材料于静脉接种10日龄鸡胚，雏鸡可正常孵出，几十天内出现病变。
(2)成红细胞增生反应的临床表现有两种类型。
①胚型(或增生型) 血液中出现大量成红细胞。肝、脾肿大，呈樱桃红色到暗红色。
②贫血型 血流中成红细胞较少。脾等内脏器官萎缩。
如将样品接种鸡胚卵黄囊或绒尿膜，8天后，可观察到痘斑样病灶。
3．动物试验 将样品于静脉或腹腔内接种一日龄的易感雏鸡，经2～9个月出现临床应答。
分离禽肉瘤病毒时，最好取幼鸡新肿瘤，接种于鸡翼膜，以接种部位触摸到肿瘤来确定阳性判定。
淋巴性白细胞增生反应，一般在14～30周龄间发生，症状和病变与急性(内脏型)马立克氏病极为相似，两者的鉴别诊断可参考下表。
成髓细胞增生病主要是白细胞总数增加，外周血白细胞数可达200万／mm2，占全部血液细胞的75%。病毒的主要侵害部位是骨髓。
(三)抵抗力诱发因子试验(RIF试验) 本试验应用于白细胞增生病病毒的测定及区分不同的亚群。
1．将被检材料和已知病毒分别接种于鸡胚成纤维细胞，同时设空白对照。
2．每3～4天继代1次，至少3次，每次继代后取部分培养物分别加入不同亚群的劳斯肉瘤病毒。
3．观察致瘤性转化灶数，如被检材料和已知白细胞增生病病毒的转化灶数比对照减少10倍以上，说明被检材料中存在禽白细胞增生病病毒。根据被抵抗的肉瘤病毒的亚群，可以确定被测定的毒株属于何种亚群。鉴定亚群的方法还有补体结合试验及表型混合试验。
(四)不产毒细胞激活试验(NP试验)
1．先用缺陷性Rous肉瘤病毒感染鸡胚成纤维细胞培养，通常不产生病毒，称不产毒(NP)细胞。
2．再接种被检样品。
3．观察4～10天，如NP细胞产生大量Rous肉瘤病病毒，则表明被检物中含有自细胞增生病病毒(它激活缺陷性Rous肉瘤病病毒)。
(五)血清学试验 可用如下方法。
1．补体结合试验(半微量补体稀释法) 用于检测禽肉瘤和白血病病毒群特异性抗原。
(1)将被检鸡或鸡胚肝制成1∶10悬液，用等量乙醚处理。被检鸡血浆用1／20体积的吐温-80处理。也可将待检的鸡胚成纤维细胞培养物进行检查。
(2)已知抗血清(V)和阴性对照血清(C)经56℃灭活30min。使用时作10倍稀释。
(3)使用的补体效价，豚鼠补体不低于1∶60，鸭补体不低于1∶6。
(4)具体操作按常规进行。
国际上通用的补体结合试验(COFAL)是将被检样品经鸡胚成纤维细胞培养三代，处理后用微量补体结合试验(抗原稀释法)检测群特异性抗原。本书介绍的方法优点是不用细胞培养，周期短，操作简便，灵敏度高。
2．免疫扩散试验 用受检鸡的羽髓、肝、肌肉或粪便均可。下面介绍从羽髓中检测禽白血病病毒群特异性抗原的方法。
(1)拔取被检鸡的新生羽4～5根，剪下羽根，在试管内加0．1～0．2ml生理盐水，用玻璃棒将髓压出，冻融3次，制成羽髓浸提液。
(2)用硼酸缓冲液(pH8．6)，配制1%琼脂，制成7孔型琼脂板，孔径为5mm，孔距为3mm。
(3)中央孔滴加特异性抗体，标准抗原和受检样品相间地加在周围6孔中。置37℃24～48h判定结果。
3．酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法用本法检测样品中的群特异性抗原，有很高的敏感性。
4．中和试验 用以检测血清中和抗体。通常在细胞培养中进行。
二、禽网状内皮组织增生症病毒(Avian reticuloendotheliosis virus)
本病毒有四个毒株，即T株(火鸡)、SN株(鸭脾坏死病毒)，DIA株(鸭传染性贫血)，CS株(雏鸡合胞体病毒)，但只有一个抗原型。它能引起以淋巴-网状细胞增生为特征的肿瘤疾病，与禽肉瘤和白血病病毒在抗原性上无关。
(一)样品采集
无菌采取病鸡脾和肝素抗凝血。注意病毒很不耐热，但在-70℃稳定。
(二)病毒分离
1．细胞培养
(1)鸡、鸭、火鸡和鹌鹑胚成纤维细胞培养均可应用。
(2)样品接种后至少育传3代，一代5天。
(3)某些毒株(如SN株)在急性感染期可能引起轻度细胞病变。一般必须用荧光抗体技术验证。
2．鸡胚接种 将样品接种鸡胚绒尿膜，产生痘斑病变。常导致鸡胚死亡，或肝、脾肿大，但不是所有毒株对鸡胚都有病原性。
3．动物试验 将样品经腹腔或皮下接种1～8日龄雏鸡。如样品病毒含量高，潜伏期约3天，并可在6～7天或2周内死亡，临床症状不明显，但有病理学变化。如接种鸡未死，可于10周后检查抗体，或观察临床症状和病理学变化，如羽毛异常、消瘦、末梢神经水肿性肿大和淋巴样细胞浸润。
T株病毒接用鸡雏，引起肝脾肿大，具有针尖大或更大的病灶，有的病例发生贫血。SN株接种鸭，引起脾渐进性坏死。DIA株接种鸭出现明显贫血。CS株对鸡无病原性。
(三)血清学试验
1．补体结合试验(检查病毒抗原) 用已知特异性血清检测接毒的成纤维细胞培养物。
2．ELISA试验 检查病毒抗原。
三、牛白血病病毒(Boyine leukosis virus)
地方流行性牛白血病以持续性淋巴细胞增生和淋巴肉瘤为特征，但多数为无症状的带毒牛。
(一)样品采集 无菌采取肝素抗凝血液，分离白细胞。
1．细胞培养 主要用于检测样品中的病毒。
(1)继代牛胎脾细胞
①4～10代的牛胎脾细胞继代后培养6～12h，令其贴管。
②接种样品白细胞悬液，脾细胞和白细胞的数量基本相等。
③37℃培养48h后换液，继续培养4～5天。
④镜检时如发现细胞单层有合胞体(含5个核以上的细胞)形成，即证明样品中有牛白血病病毒存在。
此法检查的是晚期合胞体形成，时间较长。如用F81或CC81细胞系能检查早期合胞体形成，培养2～3天即可判定结果。
(二)血清学试验
1．琼脂免疫扩散试验
(1)以8．5%NaCl溶液配制0．9%琼脂凝胶，浇注厚2mm的平板，打成七孔型，孔径为5mm，孔距为3mm。
(2)中央孔加抗原，被检血清与阳性对照血清间隔地加在周围六孔。
(3)置室温48h后判定结果。
2．PPA-ELISA
(1)用50μg／ml浓度的牛白血病病毒gP或P抗原包被过夜。
(2)冲洗后加0．2%明胶稀释液封闭。
(3)30min后冲洗，分别加被检血清、阳性及阴性血清。
(4)30min后冲洗，加葡萄球菌蛋白A-辣根过氧化物酶标记物(PPA)。
(5)30min后冲洗，加底物显色，10～15min后终止反应，测OD492nm。
(6)结果判定。OD值＞0。25为阳性；0．22～0．24为疑似；＜0．21为阴性。