薯蓣
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第408页（10578字）
薯蓣是薯蓣属(Dioscorea)的一员。生产可食块茎、球茎或根茎，有食用和药用重要性。有600以上种，完全雌雄异株。最近用D．rotundata的育种产生了雌雄同株植物，具有雌花和雄花。改良目标是直立或半直立性、相对短的生长季、产生高产块茎、抗病、皮坚韧、小圆或卵圆形。便于机械收获。高蛋白含量，保持好味道和质地。产生小繁殖体代替插枝大多数种不结籽，植物细胞培养技术有许多重要性。任何栽培品种存在着大量变异，繁殖和推广高产优质个体尤其有价值。诱导增高变异性和选育新特性品系如直立习性和无刺茎，同样重要。
(一)研究进展
1．芽和分生组织培养无性系繁殖
许多种如参薯能用节培养体在温室或大田繁殖。薯蓣属细胞和组织培养的目标之一是利用分生组织培养进行大规模克隆繁殖。
1970年代中期开始研究，腋芽产生植株和促进多芽形成，用于大规模繁殖(表18-4)，取得某些成就。大多数成功事例，是利用带有腋芽或芽(每节常有3个芽)和邻近茎和叶柄组织(除去叶)的茎切段取得的。如果切段相对地大(大于1-2cm)，常能在基础培养基(通常是MS)上发育成芽和根。如果是茎尖或顶端分生组织，则加生长素和细胞分裂素常是有益的。
种间有差异。Chaturvedi等(1977)指出，与D．floribunda茎插枝相比，三角叶薯蓣(D．deltoidea)的茎切段较难生根。后者在加NAA和IBA培养基上只有50%生根，前者则几乎全都易于生根。就三角叶薯蓣而言，NAA，IBA，2，4-D和氯酸组合能改进生根频率。
细胞分裂素和生长素的特殊类型可能是重要的。虽已证明KIN是D．floribunda节培养体的有效细胞分裂素，Mantell等(1980)发现BA对参薯的茎尖比KIN好。绝对和相对浓度都重要。随着生长素水平增高，有形成愈伤组织的倾向，例如参薯和黄独。低水平生长素加倍根形成。中等浓度细胞分裂素增进芽发育；较高水平通过早先形成的腋芽增高多芽。Chatarveko(1975)在一个第一次试验中，指出将单节插枝培养在加0．5μMNAA和硫酸腺嘌呤培养基上，生了根，然后形成若干块茎组织，长有1或2个芽。培养在加8．8μMBA培养基上的外植体，20天内，平均产生5-6个芽。Mantell等(1978)报道参薯或D．rotundata的一个节段，在3-5周内，将能产生3-5完整植株。每株可分切成3-5个节切段(每个节有一片小叶)，移植于新鲜培养基上。14-20天后，发育成新的多分枝再生植株。估计在14-20天有规律循环中，从一个节在6个月内，有可能产生65000再生植株。困难在于每个节切段必须分别切取，并转入新鲜培养基很费事。
一种困难是茎切口使培养基逐渐褐化。重复培养间和品种间反应强度不同，对生长常无影响。有意义的是，Ammirato(1982)研究D．a!ata var．gemelos，单节茎段培养产生植株后，用单节切段再次继代，不出现培养基褐化现象。用于启动初次培养体的茎切段，在转入培养基前，放在加盖培养皿里的水湿滤纸上半小时，似有所助益。培养基加抗氧剂，或低光强以抑制酚类合成，可能是有效的。
Mantell等(1978)首次注意到从不同年龄的蔓上取的节切段，对培养的反应不同。Martin等(1969)曾描述过D．floribunda和黄独不同年龄的蓣薯蔓切段对节切段繁殖的影响。同样，Preston等(1962)指出生长在长日照下的幼株新切段更易产生新植株，并测验了生长在16和12小时光周期下的植株茎切段的反应，生长在较长光周期下植株的切段，芽生长一致。
许多种(表18-4)也从离体茎分生组织发育成完整植株。采用这种技术与高温处理相组合，Mantell等(1980)取得了消除参薯flexous rod病毒成功。分生组织培养体也能用最低生长储存法或深冻保存法储藏种质。Henshaw(1982)用D．rotandata取得成功。
表18-4 薯蓣属的节和分生组织培养
节或分生组织培养产生克隆植株，确能表现高度一致性。D．alata var．gemelos节培养体繁殖的植株，其营养体生长和块茎形成出现一致性。Chatuvvedi等(1982)在一年内从单节茎插枝生产约256万植株。全株保型。
离体芽产生的生根植株的茎芽，经秋水仙素处理，产生了D．flosibunda的四倍体。用浸在0．05%秋水仙素的棉花处理2天，然后除去。30天后，发育成约10株四倍体，与二倍体相比较旺势更强，茎粗壮，叶较大。采用单节叶切段加速繁殖，取得了大量四倍体植株。用于培育D．floribunda三倍体，可能生产更巨大的块茎和较高diosgenin含量。
2．培养中形成块茎 Uduebo(1971)首次报道黄独节插枝，在加低水平生长素IAA的培养基上形成块茎。Ammirato(1976，1982)用黄独和参蓣节切段培养，直接产生块茎。黄独培养在MS基础培养基上，将能形成带根(一条)的单个芽。NAA仰制芽生长，形成块茎。相反，玉米素促进多芽生长。D．alata var．farm lisbon在MS培养基上发生了块茎、芽和根的生长，和形成块茎，加NAA的产生愈伤组织。但是，再加1μMABA形成不带愈伤组织的块茎。Asahira等(1968)报道如果培养基含有NH4+和NO3-，KIN促进节切段的芽生长，但不加NH4+时，抑制块茎形成。
薯蓣属的许多种在它的叶轴上形成小球茎，这常产生于温室内节插枝生根期间。D．foribunda节和分生组织培养体再生植株上也有小球茎形成。
Ammirato(1982)报道D．alata var．gemelos和D．bulbifera var．sativa植株，生长在连续光照下4-5个月后，产生许多气生块茎。这些块茎收获后，或使培养体变干，块茎和干植株可储存6个月之久。一次试验从9瓶中收获到37个块茎。重3-1486mg，长3-32mm。当栽在土中时，90mg长8mm以上的块茎全部出芽，产生正常植株和块茎。
其它属观察到微块茎形成，这种程序成为马铃薯的很重要繁殖方法。优良栽培品种的微繁殖和诱导产生微块茎方法，也适用于薯蓣属大田无性繁殖的品种的贮存和快速简省的栽种。
3．愈伤组织和悬浮培养的器官建成和胚胎发生 Goebel(1908)在实验植物形态学经典着作中，描述了D．sinuata和穿龙薯蓣块茎切片的芽和根再生。在极性讨论一节中，有意义地提出芽再生发生于块茎的中央，而根形成则在周缘。
块茎是培养中器官建成或胚胎发生的卓越的外植体源。但是，大田收获的块茎，常带有内生真菌，使得表面消毒无效。新收获块茎常是休眠状态的，以及块茎切片时，会发生组织养化和褐色化。
为了克服这些问题，可将块茎种在温室消毒土中，或用单节茎切段或顶尖分生组织培养体再生微块茎，则更好。储存可用以克服休眠，例如24±2℃暗培4个月。ethrel，二氯乙醇或乙醇处理也有效。外植体切取后接种在试管前，浸入1．0%抗坏血酸10min，可使组织氧化降到最低。其它抗氧化剂如半胱氨酸和谷胱甘肽可能也有效。最后，植株营养体部分如顶尖分生组织和节切段，是好的外植体材料。
表18-5列出从无组织愈伤组织或悬浮培养物再生的蓣薯种，并举出一些条件。最常的培养基附加生长素是2，4-D，而节和分生组织培养体则用IAA，IBA和NAA(表1)。在继代期间，2，4-D既启动增殖又保持无组织生长。将培养材料转入无2，4-D或较低水平2，4-D或其它生长素的二次培养基，出现了胚和或植株。这种程序是植物细胞培养体诱导器官建成，尤其是胚胎发生的典型措施。
一种例外，是D．floribunda叶枕基部不经愈伤组织发育直接形成不定芽。其它属也有直接发生器官建成和胚胎发生。有些培养体产生器官建成和发育成芽，其它则形成胚胎发生和体细胞胚，难以解释。不同荷尔蒙或环境条件可能启动这二种交互形态建成途径。或则像许多细胞培养体一样，体细胞胚启动，但茎顶端未熟先出，因而扰乱了胚性发生的来源。
大多数报道的一种状态，是充分分化的组织如节间或成熟叶组织，在培养中不能增殖，或产生能连续生长的愈伤组织。一般言之，胚性的、分生组织的或幼年组织产生活跃的细胞生长、胚和植株再生。薯蓣属或熟细胞，像许多单子叶植物一样，大部分不能脱分化，和再组织成维管束和皮层形成层。由此可知，仍在分裂中的细胞，在培养中最易生长，如离体胚、幼苗部分、幼叶柄和叶，顶尖分生组织和块茎组织。后者在皮层内有明显形成层。
薯蓣属器官建成或胚胎发生培养体的另一状态是出现混合细胞类型——一种淡色松脆组织和一种带小颗粒常生根较紧密组织。后者发生再生。再生胚或芽的成功，有赖于选择正确细胞愈伤组织类型。其它单子叶培养体尤其是草类而是如此。表2所示再生，发生于半固化培养基的稳定生长培养体。但是，体细胞胚发生于D．floribunda的悬浮培养体中。愈伤组织产生于暗培的半固化培养基上，转入培养液，先装在小培养管中，然后移入大培养三角瓶。早期研究，启动和保持生长用4．5μM 2，4-D；后来研究指出18μM 2，4-D产生愈伤组织和悬浮体，具有较高百分的胚性发生细胞簇。二种方式都能使体细胞胚成熟。如果延长培养物(老化)，水浸状组织变褐，从浓密白色球形组织产生圆锥形胚。把浓密团块有选择地转入新鲜培养基。为了胚的成熟，把小细胞簇或原胚转入加ZEA和或ABA的培养液。单用ZEA子叶发育良好，加ABA可防止过早发芽。
D．floribunda体细胞胚，悬浮在培养液中自由发育，具有正确形式和明显结构。它们起源于小球形原胚，然后形成子叶环，经不对称发育，形成单片子叶和叶鞘基部。单片子叶有叶身顶端和圆形基端。结构与合子胚相似，由于在界于二半胚乳间缝间发育，子叶成为平板形。
黄独节培养体中从腋芽产生的悬浮培养体发现相似反应。MS+4．5μM 2，4-D和0．44μM BA形成很好悬浮培养体。当将细胞簇转入MS+0．1μM ZEA培养基时，发育成体细胞胚。但再生植株很弱。
D．floribunda体细胞胚，如果以5个为一组移入MS基础培养基(不加附加成分)或单个地放入MS+谷酰胺和0．2μM ZEA，长成植株。移栽入土的40株以上，全部健壮和正常。
D．floribunda悬浮培养体，只能继代几次，以后生长和有组织发育很快下降。三角叶薯蓣悬浮培养体曾广泛应用于研究薯蓣素(diosgenin)合成。极少见有组织的结构，只见根。分析这些培养体指出，它们是高度异质的，具有广大范围染色体数和广泛多倍体性。D．Houri bunda体细胞胚胎发生再生的植株指出，旺势、叶形、大小和倍数性水平变异大，从二倍体性到多倍体性到非整倍体性。偶见白化突变体和花叶植株。
细胞培养体出现染色体变异性已为所熟知(Ammirato 1978)，但最近才鉴定出存在遗传变异性(Larkin等，1981)。体细胞克隆变异提供产生遗传改变的新类型的潜势(Evans等，1983)。因此，细胞培养体有产生有用变异体的可能性。
表18-5 薯蓣培养物的器官建成和胚胎发生
a．Kaul和Staba(1968)改进的MS培养茎。
b．改进的MS，只加NH4NO3为唯一氮源。
(二)培养方法
1．参蓣节培养的无性系繁殖
(1)温室生长植株，应在生长季内取外植体，当地上部短，正在发育中，日长。控制环境下生长的植株，光周期应控制在至少16h照光。应从幼植株取材。
(2)在节间居中点切蔓，在叶柄中段折断除去叶片，放入去污剂-水混合液中，强烈摇动3分钟，自来水洗几次。
(3)制备20%商品漂白粉(最后浓度=1%次氯酸钠)，加几滴湿润剂如吞温40。
(4)切取节切段，各节上、下和叶枕保留2-3cm。立即浸入次氯酸钠溶液。放入密封容器内，装在旋转振荡器上，振荡30-40min。
(5)立即把小片移入无菌培养皿，用蒸馏水至少淋洗12次。
(6)把节切段切成5mm保留茎和叶枕。
(7)放在0．8%琼脂固化MS培养基上，试管加盖，容许气体交换。切段应向上，插入琼脂，腋芽保持在培养基水平面上。
(8)培养在25-27℃，连续光照或16／8光周期，3-5周应发育成芽和根。
(9)无菌移去节茎切段，转入新鲜MS培养基，易于建成新培养体。
(10)能自然形成小球茎的品种，使培养体老化，能长出微块茎。长日光周期或连续光照是重要的。
2．D．floribunda体细胞胚胎发生和悬浮培养物
(1)用20%(v／v)商品漂白粉(1%次氯酸钠)表面消毒种子20min。无菌蒸馏水淋洗至少5次。
(2)把种子移入无菌培养皿的用蒸馏水浸湿的滤纸上。种子壳特别硬，直到吸水膨胀后，还不易切开。
(3)24h后，把每粒种子各别地移入第二培养皿，除去种子周围的圆环状翅，取切线切种子二刀。胚极小，位于种子的凹陷一边。种壳刚能盖着胚。切口应在胚远端，二刀相互交叉。能除毒
种子，切成斧头形，胚包埋在基部内。
(4)用一对无菌镊子夹住种壳上半部，第二对夹住下半部。把顶半部向外反转。胚应是完整的接着于二半中之一。
(5)用无菌解剖针或环，将胚刮起，移置培养基。
(6)D．floribunda适合培养基是MS盐类和维生素，附加18μM2，4-D，0．8%琼脂固化。暗培，25-27℃。4-6周产生愈伤组织。生长慢，需等待12周，方能取得足够材料供继代用。
(7)将小块愈伤组织完整地转入小培养管中，装有10ml MS和18μM 2，4-D，完全黑暗，旋转1rpm。或者，把小欧氏三角瓶放在转动振荡器上。4-6周内发育成高度可变细胞悬浮体。
(8)在解剖显微镜下，小、浓密、近于白色，球形簇，用无菌巴氏吸移管有选择性地移出，转入新鲜培养基。经几次继代后，应有足量材料供移入较大欧氏三角瓶或大培养瓶之用。在指数生长阶段，将培养体转入新鲜培养基，并保持高密度，显然是薯蓣属培养体的特殊关键。
(9)为了体细胞胚发育，悬浮体经大网孔(250μ．m)不锈钢筛过滤，用MS基础培养基洗细胞。
(10)将洗过的悬浮体，转入装有MS+0．1μM ZEA的培养管中。4-6周应出现小圆锥形胚。胚可能未熟先发芽，或反常发育。再加1μM ABA常有助于促进正常体细胞胚成熟。
(11)为了再生植株发育，胚转入半固化MS+0．1μM ZEA，500mg／l谷酰胺。如果接种体细胞胚5个以上，不加附加成分的基础培养基就足够了。光培，约4周，植株将能发育到可供移栽土中之用。应及早移栽，由于根系发育过盛。此外，培养基必须充分洗去。
(三)展望
能切取单节或单叶插枝，并再生许多植株，其遗传性相同，开辟了优良栽培品种的加速大量繁殖的途径。从这种材料能产生微块茎，提供大量繁殖体的机会。一旦取得成功，就能提供接种材料另一种给源。农家可能不需要再保存好多收获物用作下年种植。能从微块茎建成悬浮培养物和长成体细胞胚，为大规模克隆繁殖创造着可能性。但是，必须对再生植株的遗传稳定性有绝对把握。对此已有所报道。烟草多数继代的培养物和在指数生长期保持了它们的遗传完整性。保持少数几个月的胡萝卜培养物。再生了外表正常植株。阐明细胞无性系所需条件尚待做更多研究。
细胞培养的体细胞无性系变异能产生有益突变，已如上述。马铃薯体细胞无性系变异体，曾分离出早疫病抗性，生长习性改变，块茎形状和色和成熟期。这些特性变异归之于染色体数和结构的变化。无性繁殖能保持稳定。薯蓣属细胞培养体已出现的和将继续产生的变异体，将有可能育成直立茎植株，不再需要支撑物，无刺和小、卵形，硬皮块茎，可供机械收获。参蓣和黄独间杂种产生气生块茎，非常奇特，翻开蔓就能收获。这是利用体细胞克隆变异创造新品种的又一例证。
细胞融合，基因转移，或选择变异体，已取得改进的抗病性、高光合效率、或较高产量，都有巨大前途。采用节、茎尖和分生组织培养取得优越品种克隆繁殖，现已成功。薯蓣属细胞培养技术应用于作物改良是有价值事业。
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