白杨
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第657页（15246字）
白杨(Populus alba L．)归于杨属(Populus)，有34种，2n=38。其出现二次多倍体性，基数可能是n=8。四倍体与二倍体欧洲白杨杂交产生三倍体的生长较二倍体的为优越。
(一)研究进展
1．愈伤组织培养 Mathes(1964)首创建立长期白杨愈伤组织培养体。用三倍体P．tre-muloides茎外植体培养在含有各种生长素和一些复杂生长促进物质如CW、CH、YE和ME的基础培养基上。2．6-4．3μM NAA加100ppm CH或ME取得满意的生长。加0．5%柠檬酸从愈伤组织分化生根，加5．7μM IAA和2．3-4．6μM KIN诱导生了芽。继之，在同块愈伤组织上诱导产生了根和芽。可是它们似乎不是相互直接连成再生植株，虽然生长在同一切愈伤组织上。
Wintor(1968)报道三倍体P．tremuloides生长在MS琼脂培养基上，附加2．2μM2，4-D，从根萌芽切段启动了松散愈伤组织。暗培中生长旺，多变和无色，但是当转放在1000叹烛光每隔4天5min，与暗培对照相比较，在强光16h光周期下变为红色，但保持松散，生长似有增进，虽不显着。还用不加CW和其它复杂物质的Mathes培养液培养同样愈伤组织研究生长素对诱导生根的效果。根萌芽切段很快长成愈伤组织，当用改进的WS培养基加2．2μM2，4-D，不能生根。当2，4-D降低到0．2μM，愈伤组织生长变慢，但生了根。再者，组织保持原状液培1、2或3月，然后继代在低2，4-D琼脂培养上，在老化来源组织首先形成根，而不是启动外植体大小。
Winton(1968)和Wolter(1968)分别用改进的WS培养基从白杨愈伤组织培养体取得再生植株成功。Winton暗培三倍体P．tremuloides愈伤组织培养物取得芽启动，培养基是改进的WS加0．2-0．9μM BA，在0．2μM BA产生少数旺势芽，但当加0．7μM BA时，出现矮肚多芽。取芽培养在WS加0．2μM 2，4-D和4．6μM KIN，323每天光照16h，发生了根。Wolter(1968)，用已保持7年的二倍体P．tremuloides愈伤组织培养物，测验不同浓度0-53．7μM NAA和0-2．2μM B对器官建成的效应。最适芽诱导培养基是WS加0．4-0．9μM BA，BA高于2．2μM有抑制作用。最适根形成是WS加1．3-5．3μM NAA。大多数芽发生在培养2-3月后掩埋在琼脂培养的愈伤组织内部。芽生长和外部形态有相当大差异。大多数情况下，愈伤组织片段上长出的芽，生长极差，表现死亡状。愈伤组织片段生长在生长素培养基8周后，出现根启动。芽转入WS不加生长素和细胞分裂素，光照12h，再生植株。3-4周内芽基部生根。
Winton(1968)和Wolter(1968)诱导生根结果的不同。由于(1)供试P．tremul-oides组织的倍数性水平不同，(2)愈伤组织培养体年龄，和(3)培养条件，光、温、湿度。
Winton(1970，1971)采用Winton(1968)相同培养条件，从三倍体P．tremwloides，四倍体欧洲山杨P．tremula愈伤组织培养体取得再生植株。Chalupa(1974)取得几种Po-pulus愈伤组织培养物的再生植株，包括P．tremula，结果指出一般培养在改进的LS愈伤组织小块有60-80%诱导生芽，BA浓度是0．2-22．2μM。芽在改进的WS加2．0μM NAA2-4周生了短根。芽转入无菌泥炭∶沙(3∶1 v／v)加改进
大和微量元素，不加细胞分裂素，加1．0μM NAA和5．8mM蔗糖，根发育较好。80%以上的芽在2-3周内产生长壮根。Chalupa(1977)比较愈伤组织再生植株和母株的生长，二者相同，叶色、形和大小、光合率以及染色体数也相同。Lester等(1977)观察到株高，分枝数，叶特性和染色体数在黑杨(P．nigru cv．italica)和Euromerican杨(P．euroamericana Dode)若干无性系的愈伤组织再生植株间差异很大。黑杨愈伤组织产生的植株克隆内也有变异。
Ahuja(1983)用AC培养基(改进的WP，表2)加5．3-10．7μM NAA和0．4μM BA培养白杨茎切段，诱导产生紧密愈伤组织。后来(未发表)指出ACM加2，4-D 4．5-9．0μM诱导白杨外植体产生愈伤组织，能在暗或暗淡光(200-500lx)生长。转入ACM加硫酸腺嘌呤0．1mM，BA 1．7-2．2μM和NAA 0．1μM诱导生芽，生长在16h光周期2000-3000lx。一个欧洲白杨(P．tremula)无性系，把芽转入AC加IBA 2．5μM和NAA0．5μM再生植株。但由于长期培养愈伤组织培养物伴生遗传变异，这种方法不合保种型的克隆繁植目的。就此而言，器官培养，尤其分生组织培养似能产生相对较稳定(遗传)微繁殖植株。
2．器官培养 Whitehead等(1977)研究黑杨、加拿大白杨和云南白杨腋芽微繁殖潜势。芽外植体培养在改进的MS加2%蔗糖，0．54μM赖氨酸和0．1mM硫酸腺嘌呤10．9μMBA，4周内生芽，长到足够长度后切成5mm小段，接种在同样培养基上。一旦开始芽增殖，转入第二培养基，含0．4μM BA和0．1μMNAA，供进一步增殖和生长。6-8周后，每芽外植体形成120-220芽，有些长达6-8cm。或移入生根培养基含BA 0．04μM和NAA 0．05μM，或移栽在泥炭中。无菌条件下，1-2周内启动生根。另一方面，这些芽切成5mm小段，培养在第一培养基上，启动另一轮芽增殖。基于此估计每年每个芽繁殖率为106再生植株。
Ghristie(1978)采Whitehead等(1977)微繁植程序，从杨和白杨：P．cunescens，P．alba×P．glandulosa，白杨×欧洲山杨，欧洲山杨，和P．tremuloides取得再生植株。取幼株芽产生的茎叶启动生长后，继代以增高繁殖率，每月每个芽培养体产生10个茎叶。经在琼脂培养基上生根后，洗去琼脂前，放入温室2天，以利适应。然后除去大部分琼脂移入无土生长培养液钵内。钵栽再生植株喷杀菌剂，放在湿室，长日照1-14天。90%生存。待高达10cm，移栽大田。3月内高可达1．5-2m。全部组织培养产生的植株，显然与母株相同。
Ahuja(1983，1984)Ahuja等(1982)和Muhs等(1983)用欧洲山杨幼和成年树的器官培养(芽、叶盘和根)。还用了P．tremuloides和其杂种(杂种白杨的同样器官培养。用苗圃内选株的吸根建成的幼株芽启动培养。继而，从选择的成年树直接取初生芽启动芽分生组织培养物。研究了15-40年龄白杨和杂种白杨无性系100株以上的芽分生组织培养体的再生潜势。先采用白杨无性繁殖的四步法(图25-1)。
这种方法包括∶(1)芽分生组织培养在AC-1(AC+0．1mM硫酸腺嘌呤+2．2μM BA)(2)微芽生长和增殖用AC-2(AC+0．1mM硫酸腺嘌呤+2．2μM BA+0．1μM NAA)，(3)微芽培养在AC-3(AC+2．5μM IBA+0．5μM NAA)诱导根分化，和(4)把(3)的再生植株移栽钵中(除去根上琼脂后)，和在人工气候室和温室锻炼后，移栽大田。这种4步法，减去第一步成为三步法(图25-1)，分生组织锻炼和增殖在AC-2上完成，对生长和分化无多大影响。后来减去步3(生根培养基)，微芽直接移入高压蒸气消毒无土钵培养液中，高湿度控制环境下锻炼，并诱导生根。由此成为二步法(图25-1)。Ahuja(1984)采用2步微繁殖法不仅省钱，也能缩短组织处在培养条件的时间。这些试验取得芽分生组织的茎叶分化，极少见愈伤组织。几乎是从芽分生组织上直接分化芽。细胞学观察2n=38二倍体。采用组织培养技术，从大量白杨和杂种白杨无性系再生了约5000植株。测验100个隆的结果，培养在AC-2芽分生组织约500%分化茎叶。扩大荷尔蒙浓度的AC培养基(0-22．2μMBA，或0-22．7μM ZEA和0-0．1μM NAA)和不同培养条件和树龄(取组织外植体时)测验非反应的白杨无性系的再生潜势。
图25-1 简化微繁殖程序的示意图。先用四步培养法，后来减缩到3步，然后2步。目前，二步法已成功地应用于大量白杨和杂种白杨无性系的微繁殖。
组织培养技术虽已显示出白杨的无性繁殖，但已涉及年龄、性别和白杨基因型的作用。Ahuja(1983)测验了欧洲山杨(2n，3n，4n)、P．tremuloides(2n)和其杂种(2n)的已知年龄(15-40)和性别(雄或雌)的再生潜力，以求回答这些问题。结果指出白杨克隆年龄和、或性别对离体培养茎叶分化无多大影响，以基因型对体细胞分化影响最突出。
除芽外植体外，也进行叶盘和根外植体培养诱导茎叶再生。叶盘和小叶培养在AC加硫酸腺嘌呤0．1mM，BA 2．2μM和NAA 0．1μM，能诱导产生茎叶分化。只有杂种克隆叶盘产生的微芽能再生植株。若干白杨无性系的再生植株根外植体培养在AC加硫酸腺嘌呤0．1mM，BA 2．2μM和NAA 0．1μM也能分化茎叶。全都从根外植体直接(不经愈伤组织形成)分化产生的。由于已知白杨吸根能自然萌发茎叶，根外植体培养法也能用于克隆繁殖，如果能保持合理的高繁殖率的话(至少每外植体10株)。
3．悬浮培养和原生质体培养 细胞悬浮和愈伤组织培养体内通过体细胞胚胎发生微繁殖是新希望新途径。Ahuja(未发表)建立了白杨细胞悬浮培养体，用AC加4．5μM 2，4-D，观察到少数几次分裂。但未见体细胞胚胎发生。
Ahuja(1981，1982)分离和培养若干根种的原生质体。少数树木种的原生质体培养体观察到持续细胞分裂和克隆和愈伤组织形成。除柑桔属外，其它树种尚未见再生植株。从白杨幼苗和叶分离出原生质体。培养后，观察到个别原生质体出芽频率高于细胞分裂。未见植株再生。
(二)培养程序
1．器官建成
(1)用0．3-0．8cm茎或叶柄切段为外植体。经。3-5%次氯酸钠加1-2滴吐温80表面消毒5-10min。无菌蒸馏水充分洗3次。
(2)固培，附加：WS(Wilton1970)0．5mM肌醇，4．0μM烟酸，0．3μM硫胺素和2．2μM2，4-D，或AC加5．3-10．7μM NAA，能用4．5-9．0μM 2，4-D代替。取得紧密色淡的愈伤组织，用AC加2，4-D和BA 0．04-0．44μM。全部培养基加蔗糖58．4mM和琼脂8-9g／l。用0．1N HCl或NaOH调节pH为5．6-5．8。1．2kg／cm2和120℃高压蒸气消毒20min。暗培或保持在25℃，光周期16h，光强200-1000lx。
(3)每隔2-4周继代在同样培养基上。
(4)为了诱导茎叶，愈伤组织转入无菌培养基WS加0．22-0．66μM BA或LS加0．47mM精氨酸或0．22-22．22μM BA或AC加0．1mM硫酸腺嘌呤，2．2μM BA和0．1μM NAA。
(5)为了诱导根，愈伤组织转入无菌WS加1．0-5．3μM NAA。
(6)取茎叶转入无菌培养基，其组成：(1)WS不加荷尔蒙，12h光照，(2)WS加2．0μM NAA或无菌珍珠岩加沙(3∶1v／v)混合物加
NAA或(3)AC加2．4μM IBA，0．53μM NAA不加赖氨酸和肌醇，光周期16h，光强2000-4000lx。
(7)带根再生植株移入无土钵混合液中，间歇喷雾或高相对湿度(70-90%)约2周，转移温室，进一步锻炼。
2．芽分生组织培养：4步微繁殖法(表25-7)
表25-7 白杨微繁殖系统
a．Y=幼年；M=成年．
(1)用充分冷冻处理的休眠芽或春夏间活跃生长的除去顶尖和腋芽。切取温室生长的吸根芽用以启动培养体。冬末或早春对苗圃生长的材料(温室外)或成年树除去顶尖或腋芽。将芽放入塑料袋，4℃冷藏备用，或直接用于芽外植体或分生组织培养。
(2)芽表面消毒：先用乙醇淋洗，0．15-3%次氯酸钠(v／v)加吐温800．05%消毒15min，无菌蒸馏水淋洗3次，低倍解剖镜下除去芽鳞片。把芽切成1-3mm小段，培养在琼脂培养基上。为了降低污染，Ahuja(1983，1984)提出，消毒前，把用牙签擦芽，浸入1%去垢剂溶液，然后将芽放入去垢剂水溶液30min。除去外层鳞片，用5%次氯酸钠水溶液加1-2滴吐温80，处理10min，把芽转入1%次氯酸钠10min，在低倍解剖镜下除去残留鳞片，无菌蒸馏水充分淋洗3次。切成1-3mm小段主要含有分生组织，培养在固体培养基上。
(3)芽外植体转移加以锻炼和芽诱导，用固体MS培养基加：硫酸腺嘌呤0．1mM，赖氮酸0．5mM，和BA2．2μM，或AC加硫酸腺嘌呤0．1mM和BA1．7-2．2μM。二者含蔗糖58．4mM和8-10g／l琼脂。用0．1N HCl或NaOH调节pH到5．6-5．8。高压蒸气消毒1．2kg／cm2，120℃，20min。
(4)培养体保持在25℃，16h光周期，光强1-3000lx或2000-3000lx和相对湿度70%。
(5)2-4周后，培养物转入茎叶增殖培养基，MS加硫酸腺嘌呤0．1mM，赖氨酸0．5mM，BA 2．2μM和NAA 0．1μM，或AC加硫酸腺嘌呤0．1mM，BA 1．7-2．2μM和NAA 0．1μM。
(6)切取侧芽继代在茎叶增殖培养基上(每隔3-4周)，以保持有规律地为微繁殖提供微茎叶。
(7)4-8周后，切取微茎叶，转入MS或AC加IBA 2．5μM和NAA 0．5μM，不加肌醇和赖氨酸，诱导生根。
(8)将再生植株移出培养板或试管，除去根部琼脂，移入无土钵混合物，放入控制环境下，间歇喷雾2周，逐渐降低相对湿度，锻炼再生植株。
3．芽分生组织培养：三步和二步微繁殖法(Ahuja，1984)
(1)制备芽分生组织，程序如上述。
(2)芽分生组织接种在AC固体培养基(表25-8)加硫酸腺嘌呤0．1mM，BA 2．2μM和NAA0．1μM以供锻炼和茎叶增殖。
(3)6-8周后，切取微茎叶转入AC加IBA 2．5μM和NAA 0．5μM，不加肌醇和赖氨酸诱导生根，8-15天内产生根。
另一方法，离体微茎叶产生的再生植株，由直接将微茎叶培养在高压蒸气消毒的无土钵混合物，放入塑料袋中，有透明蓬盖的控制室内22℃，70%相对湿度，16h光周期，光强3000-4000lx，生根而得，8-15天生根。
(4)生根后，再生植株放入控制室内锻炼4周，移置温室4周，然后移栽大田。
4．叶盘培养
(1)用3-5%次氯酸钠水溶液加1-2滴吐温80表面消毒5min。无菌蒸馏水充分淋洗3次，每次5min。
(2)用木塞钻孔器切取叶盘(5mm)包括中脉。培养在AC(表25-8)加硫酸腺嘌呤0．1mM，BA 2．2μM和NAA 0．1μM。含58．4mM蔗糖和8-9g／l琼脂。用0．1NHCl或NaOH调节pH到5．6。高压蒸气消毒培养基20min，1．2kg／cm2和120℃。
(3)培养体保持在25℃，16h光周期，光强2000-3000lx和相对湿度70%。
(4)8-12周后，从叶盘培养体切取微茎叶，诱导再生植株如上述。
5．根切断培养
(1)在无菌条件下从无菌再生植株切取根切段(长1-2cm)，培养在固体AC加硫酸腺嘌呤(0．1mM)，BA．2．2μM和NAA 0．1μM。4-6周从根切段诱导产生了芽。
(2)茎叶伸长后，把带根微茎叶移入无土钵混合液中，或从微茎叶再生再生植株，法如上述。
6．原生质体分离和培养
(1)将冬或早春从白杨树切取枝(带有休眠芽)，放入塑料袋，4℃。
(2)温室或控制培养箱内萌发芽，产生幼新叶，供原生质体分离用。
(3)3-5%次氯酸钠加1-2滴吐温80，表面消毒叶5-6min。无菌蒸馏水充分洗3次，每次5min。
(4)无菌条件下用无菌解剖刀刮去下表皮。把叶切成小片(1cm2)，撕成1mm条。
(5)取1g叶培养在10ml酶溶液中：0．5%纤维素酶R-10，0．1%macerozymeR-10，0．1%牛胰蛋白和0．7M甘露糖醇，溶于CPW溶液，pH5．6。CPW组成：CaCl2·2H2O0．7mM，KH2PO4 1．2mM，MgSO4·7H2O 1．0mM，和Ca(NO3)2·4H2O0．1mM。
(6)暗培，25℃，相对湿度70%，振荡30rpm20-22h。
(7)80μM不锈钢筛过滤，离心100g6min，使原生质体和残屑在0．7M甘露糖醇加CPW溶液中片状沉积。
(8)把沉积物再悬浮在20%蔗糖+CPW中，离心100g 15min。收集上浮原生质体，用0．5M甘露糖醇+CPW洗3次。
(9)原生质体再悬浮在AC培养液中，不加赖氨酸，附加Casamino acids100mg／l，谷酰胺3．4mM，抗坏血酸5．6μM泛酸钙2．0μM，BA 2．2μM，NAA2．6μM，IAA2．8μM，2，4-D 0．09μM，甘露糖醇0．54M，葡萄糖99．9mM和蔗糖29．2mM。pH5．6，0．2-0．45微孔过滤。原生质体植板在薄层培养基中，密度103-5×104／ml。培养在25℃，相对湿度70%．光周期16h，扩散光200-300lx，一周，培养体移置1000-2000lx光照下。
(三)微繁殖
可用愈伤组织，器官，细胞悬浮物和原生质体培养物诱导植株再生。树木种组织外植体虽难以离体培养生长和分化，Brown等(1982)，Oavid(1982)曾采用前三种组织培养法，取得了许多树种微繁殖成功。迄今利用胚、子叶、幼苗和幼株产生幼年组织进行组织培养研究(表25-7)。困难在于在树成年前，不能预见幼苗的状态。为此，要着重探索组织培养方法，不仅能取得优良成年树种的快速无性繁殖，同时要省而有效。
表25-8 WS、WP和AC基础培养基组成
a·MS，Murashige和Skoog培养基(1962)；WS，Wolter和Skoog培养基(1966)；WP，Lloyd和McCown木本植物培养基(1981)；AC，Ahuja白杨培养基(1983)．
Bouley(1979)提出100年龄Sequoia sempervirens批量无性系的离体培养技术，Gupta等(1980)报道100年龄Tectona grandis树末梢和腋芽外植体培养的微繁殖。最近，Mas-crenhas等(1982)能以微繁殖成年优树(10-20年龄)Euealyptus树。Anuja(1983，1984)证实了15-40年龄P．tremula，P．tremuloides和其杂种芽分生组织培养的快速无性繁殖技术。
(四)展望
最近组织培养技术改进，不仅能从幼年材料也能从成年优树快速无性繁殖。茎尖或芽分生组织培养是白杨最有希望立即应用的技术，其它硬木也适用。优点是(1)茎叶分化频率高，(2)繁殖体遗传稳定性水平好，(3)成年树可望克隆繁殖和(4)商业可行性。
细胞悬浮培养物的体细胞胚胎发生，是微繁殖的有希望新途径。白杨尚待研究。细胞悬浮物的未来应用，在于高频率批量繁殖遗传稳定的体细胞胚，然后用凝胶液滴技术(Sharp等1982)或包埋在有机材料(生物降解多聚体)中成为合成种子。
白杨原生质体曾经分离和培养，尚未见植株再生。无性杂交可能从有性未成熟优树或有性不亲和或不育树或木本与草本植株间取得遗传信息交换。这些研究可能为了解成年树的生长和分化，也可能通过基因转移或无性系变异产生新奇优质基因型提供有价值线索。
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