分子荧光分析法
出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第441页（4866字）
分子在吸收一定的辐射能量之后跃迁至较高的电子能级而处于激发态，激发态分子不稳定，迅速经历振动松弛和内转化过程而丧失一部分能量，衰变到第一电子激发态的最低振动能级，分子荧光是处于这一激发状态的分子在经历辐射跃迁衰变到基态的过程中所伴随的发光现象。
分子荧光具有激发光谱、发射光谱、荧光强度、荧光寿命、荧光量子产率和荧光各向异性等种种特性。利用分子荧光来进行物质的定性或定量测定以及获取其它有关信息的方法，称为分子荧光分析法(简称荧光分析法)，如今已发展成为一种重要且有效的光谱化学分析方法。
1575年N．Monardes首次发现荧光现象，此后在17世纪和18世纪中，虽然陆续发现了一些发荧光的物质，但对荧光现象的解释却几乎没有什么进展，直至1852年Stokes才初步揭示了荧光现象的本质，判明荧光现象并非光的漫射作用，而是物质吸收光能后产生的光发射。他还由发荧光的矿物“萤石”推演而提出“荧光”这一术语，并指出荧光现象可能用来作为分析手段。
1867年Goppelsroder应用铝－桑色素配合物的荧光进行铝的测定，是历史上首次的荧光分析工作。1880年Liebeman最早提出了有关荧光与化学结构关系的经验法则。
进入20世纪这后，又陆续观察到共振荧光、电子冲击发光和敏化荧光等现象，并进行了荧光量子产率和荧光寿命的测定。与此同时荧光测定的仪器也有了相应的发展，1928年第1台光电荧光计问世，1948年推出了第1台自动光谱校正装置，1952年已有了商品化的校正光谱仪器。
尽管首次发现荧光现象至今已有400多年的历史，但荧光分析法的蓬勃发展和广泛应用于各个领域还是近几十年的事。尤其是本世纪70年代以来，在其它学科迅速发展的影响和推动下，随着激光、计算机、电子学和光导纤维等新的科学技术的引入，使荧光分析法进入一个迅速发展的时期，至今方兴未艾。随着激光光源、光学多通道检测器、光子计数、光源调制和相敏检测以及微机联用和软件开发等方面的不断改善，各种新型荧光分析仪器不断涌现，在灵敏度、分辨率、稳定性、扫描速率、自动化程度等方面水平不断提高，测定功能不断扩展。与此相应，各种荧光测定新方法、新技术也迅速兴起和发展。
荧光分析法由于灵敏度高、线性动态范围宽、选择性较好且仪器易于普及、操作简便快速，因而在工农业、医药卫生、环境保护、公安情报和科学研究等部门得到了日益广泛的应用。
在测定的灵敏度方面，随着高灵敏荧光试剂和增效分析试剂的应用和测定仪器性能的改善，常规荧光分析法的灵敏度日益提高。近年来随着激光光源的应用和微弱信号检测技术的进展，在有些情况下激光荧光光谱分析法已可实现单原子或单分子检测，达到了光谱分析的灵敏度极限。
复杂试样中单一组分的选择性测定或多组分同时测定的需求，促进荧光测定的某些新技术(包括与其它分析手段的联用技术)的产生和发展。在开拓利用各组分荧光特性的差异的基础上，产生了诸如利用激发光谱或／和发射光谱方面的差异(即光谱的选择性)而建立的同步(扫描)荧光测定、导数荧光测定、导数－同步荧光测定和三维荧光光谱技术；利用荧光寿命的差别而建立的时间分辨荧光测定；利用荧光寿命的差异及调制激发时所产生的调制发射在相角上的关别而建立的相分辨荧光测定；利用荧光体转动扩散速率的差异而导致恒态荧光偏振的差别而建立的荧光偏振测定，等等。某些有机化合物(如多环芳烃致癌物)彼此化学结构颇为相似，又各存在多种同分异构体和衍生物，它们的室温荧光光谱呈宽带状又相互重迭，导致表征和鉴别上的困难。低温下可使分子光谱的谱带窄化，是提高测定选择性的有效途径之一，从而促进种种低温荧光测定技术的研究和发展。
80年代末提出的荧光各向异性选择性技术，显示了荧光分析法在选择性方面的内在优势。
这一技术采用频域测量的办法，配合计算机数据处理，使得两种组分即使光谱相似、荧光寿命相同且极限各向异性数值相近，只要它们的转动相关时间有差异，也可直接加以分辨。这给蛋白质和酶模拟体系的荧光探针法研究提供了一种有效的测定手段。
圆二色性是一种手性测定方法。许多生物分子由于具有手性而给测定带来了附加选择性。
测定圆二色性以往通常采用吸光光度法，70年代提出了圆二色性的荧光检测，除使检测的灵敏度提高之外，因可同时测定总荧光强度，增多了潜在的信息内容。此法已开始用作高效液相色谱和毛细管电泳等分离技术的检测手段。
化学计量学的兴起，也为荧光分析法选择性的改善开辟了新的途径，在背景校正、光谱分辨、多维信号量测及多组分同时测定等方面，收到了明显的效果，日益吸引人们的研究兴趣，在荧光分析中的应用将会越来越多。
近年来，致力于发展各种荧光测定方法间的结合技术以及荧光测定与其它分析方法联用技术的研究工作日益增多，旨在进一步提高方法的选择性或／和灵敏度。
最简单易行的一种结合技术是导数－同步荧光测定，它同时发挥了同步荧光和导数荧光两种测定方法的优点，已成功地应用于多组分的同时测定。相分辨荧光测定与同步激发技术的结合，已成功地应用于多组分芳烃的测定。
时间分辨或相分辨荧光测定这一类发光的动态测量技术，近年的研究进展很快，有效地应用于光谱重迭的混合物分析。利用多维数据阵列将激发、发射、时间(或频率)等因次作为选择性参数结合起来，对混合物的分析将大有裨益。超声喷射光谱与同步荧光测定的联用，获得的多环芳烃的荧光光谱接近于线状光谱，分辨率大为提高。许多天然荧光物质具有相似的荧光光谱，某些荧光物质具有不稳定性，更有许多物质本身并不发荧光，这些因素使荧光分析法的应用受到限制。由光化学反应和荧光检测相结合而产生的光化学荧光分析法，在很大程度上克服了上述的局限性，且不同能量的光子将诱发不同的光化学反应，这种专一性对提高分析方法的选择性很有意义。荧光测定与动力学分析(尤其是速差动力学分析)以及停流技术联用，同样有利于提高测定的灵敏度和选择性。
荧光检测与色谱、电泳等分离手段联用，兼有色谱(或电泳)的高分离效率及荧光检测的高灵敏度，在解决化学性质相近的组分(如氨基酸、多肽、核酸及多环芳烃等)的分离分析方面收到显着的效果，在生命科学和环境科学中有着广泛的应用前景。
荧光免疫测定和光纤化学传感器这两方面的近年进展，十分引人注目。
为克服放射性标记所带来的问题，现已开发多种非放射性标记的免疫分析方法，荧光免疫测定有希望成为比较理想的一种方法。荧光免疫测定虽然存在背景荧光干扰和荧光猝灭的问题，但应用时间分辨测量技术及采用荧光寿命较长、Stokes位移较大的标记物，已经可以加以解决。稀土金属(铕和铽)的螯合的，是目前常用的比较理想的一种标记物。Diamandis等人在以Eu3+与4，7－双(氯磺苯基)－1，10－菲咯啉－2，9－二羧酸(BCPDA)的螯合物为标记物的基础上，提出一种新的通用免疫分析试剂，使得多重标记手段不仅不引起浓度猝灭效应，而且能有效地提高灵敏度，理论上的放大系数约达104。
荧光免疫测定已越来越多地被应用于蛋白质、激素、病毒抗原、药物及DNA杂交体的分析。光纤化学传感器的发展与应用，为小量试样的痕量组分提供了简单、快速和现场的分析手段。
光纤化学传感器的重要组成部分是固定化试剂相。
为了高选择性地检测某些痕量组分，人们已将免疫反应的原理应用于荧光检测的光纤化学传感器的设计，如将标记的抗体或抗原共价偶联到石英光纤末端的表面上，或者将标记的抗体(或抗原)与用另一种标记物标记的抗原(或抗体)一起密封于由渗透膜构成的反应室里(这两种标记物之间会发生均相荧光能量转移)，以构成光纤荧光免疫传感器。
新近已研制出可再生的光纤的或平面波导的荧光免疫传感器。
新的荧光试剂的发展，表面活性剂和环糊精等一类增效分析试剂的应用，使荧光分析法的灵敏度和选择性以及实验条件的宽容性得到很大的改善。
合成新型增效分析试剂，开拓增效分析试剂配用的有效体系，研究增效作用的机理，以及设计合成各种灵敏度高、选择性好的新型荧光试剂等等，仍然是一个有吸引力的研究领域。
荧光分析法在生物、医学和生物化学的研究中，近年来的重要应用有如恶性肿瘤的激光诱导荧光诊断和光化治疗，激光微荧光法研究抗癌药物与癌细胞的相互作用情况，荧光探针法研究蛋白质的构象及其变化、蛋白质与配体间的相互作用及其动力学，以及荧光法用于DNA的测定与编序、研究多环芳烃致癌物与DNA之间的相互作用等等。
时间分辨光谱学在近20年来一直是十分活跃的研究领域，越来越多地应用于改善定性分析和定量分析方法，提供结构和动态的信息。时间分辨技术的发展已产生了超快速光谱学，其时间标度约从10fs到100ps，而采用光学的时间分辨手段，已有可能达到200fs的分辨能力。
超快速光谱技术的发展，必将推动对分子荧光的有关理论的进一步深入研究。当时间标度达10ns时，人们可以研究荧光的衰变；时间标度达100ps时，可以研究荧光各向异性随时间的变化；达1ps的时间标度时，可以研究溶剂松弛过程。
随着时间标度达到更小的数值时，便可能观察到荧光光谱的某些重要特征：(1)没有松弛的荧光。因为达到fs的标度时，振动松弛相对来说就显得慢了，这样便可能观察到来自振动态的荧光；(2)根据Heisenberg不确定原理，具有数百nm带宽的每一跃迁，必定与寿命至少有fs级的某一状态相联系，而有吸收就应有发射，尽管其效率有差别。
从这个意义上来说，每种物质实质上都会发荧光。
荧光分析法今后的发展，仍将不断得益于激光技术、计算机技术、微弱光信号检测技术和光导纤维技术的发展与提高，以及荧光试剂、增效试剂和荧光标记物的时一步开拓。．随着时间的推移，此法的应用潜力也将得到进一步的发挥，尤其在生命科学领域中，展现了十分宽阔的应用前景。
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(厦门大学博士生导师许金钩教授撰；博士生导师陈国珍教授审)