生物细胞冷冻蚀刻电镜技术

出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第886页（4091字）

冷冻蚀刻电镜技术，又称冷冻复型电镜技术，是一种生物细胞电镜样品制备技术方法。

利用这种方法所制取的复型膜，可以充分显示细胞膜、核膜和备种细胞器膜表面微细结构的变化，其分辨率可以以达到2nm。优于透射电镜超薄切片法的分辨率(2．5nm)。

因此，该技术已成为近代研究细胞生物膜结构、开展分子生物学研究的重要形态学手段之一。

自从1950年以来，在国外先后有瞿尔(C．E．Hall)、梅里曼(H．T．Meryman)提出了有关冷冻蚀刻的雏形；到60年代穆尔(H．Moor)、布兰顿(D．Branton)等，使该技术得到改进并进入比较成熟阶段，1970年以后，又经过斯蒂尔(R．L．Steere)、西占贡赤堀宏等的不断改进，使该技术更加成熟，并很快发展起来，在国外文献中出现了大量以次序冻蚀刻法为研究手段的资料。

1978年河北医学院电镜实验中心，在国内最先采用冷冻蚀刻技术，并于当年9月在桂林召开的全国解剖学年会上发表了“冷冻蚀刻技术初步实验成果”的论文报告。1980年以后，国内又有几个单位引进了有关实验设备，并陆续发表了细胞学、组织学、肿瘤学，生殖生物学等医学生物学实验研究工作方面的学术论文，并有李文镇等编写出版了国内第1部冷冻蚀刻技术专着－《组织细胞冷冻复型电镜图谱》。

冷冻蚀刻法的技术特点：(1)样品处理采用液氮冷冻，尽量消除理化因素的损伤，使细胞超微结构更近于生活状态；(2)通过样品切断－蚀刻，可充分显示不同层次的细胞膜微细结构及其膜表面镶嵌蛋白颗粒，为生物膜和分子生物学研究提供了实验手段；(3)采用投影喷涂制取铂－碳复型膜，使电镜图像具有浮雕样的鲜明立体感，可得到细胞超微结构的三维图象，有利于细胞重建工作的开展；(4)复型膜具有分辩力高，能耐受电子束轰击，可以长期保存等特点。

冷冻蚀刻法所需要的设备仪器，主要包括两类：一类是附件型，此型仪器的代表设备是日本日立HFZ－1型切断装置、FE1型冷冻蚀刻装置和HUS－5型真空喷镀仪，又称“铜块法”；另一类是专用型，此型仪器的代表设备是日本生产的EIKO．FD2A、FD－3A和西欧列支敦士登生产的Balzers－360型等冷冻蚀刻装置，此类设备的许多技术程序均为自动操作与控制。

尽管仪器设备不同，其技术操作程序基本一致，都需经过：样品的预处理(戊=醛固定、甘油防冻处理)，样品及切断装置的液氮冷冻，在一定真空度和温度下，将放入喷镀仪中的样品进行切断和加温蚀刻，对样品断面进行喷镀制取铂碳复型膜，把样品入腐蚀液中用铜网捞取复型膜，最后用透射电镜观察。

1980年以来，冷冻蚀刻法的技术及有关理论方面，国内外均有很大发展。在冷冻蚀刻技术方法上有了许多改进，并出现了以“快速冷冻复型法”为代表的技术方法，其主要技术特点是：在样品的预处理中，免去戊=醛固定和甘油防冻处理，改用快速冷冻装置，将新鲜样品放入其内与浸泡于液氮中的电镀金板快速接触冷冻，再将冷冻后的样品放入FD－2A冷冻蚀刻仪上，按常规技术程序操作，直至制出复型膜。利用上述方法所得到的复型膜，其细胞超微结构更接近于生活状态。

该技术1979年由日本山田类智首创，在中国由李向印等于1981年建立这一技术方法1983年正式发表了学术论文。在冷冻蚀刻技术理论方面，1974年科勒(J．K．Kohler)等就冷冻蚀刻技术冰晶形成的理论方面，提出了自己的看法；菲希尔(K．A．Fischei)等通过实验研究，提出了克服冰晶形成的条件；松本明等，又在当年对蚀刻真空度、蚀刻与样品温度的关系，发表了学术论文。

在中国李文镇(1982)、应国华(1990)等进行了有关实验研究，先后发表了冷冻复型技术经验介绍，冷冻蚀刻技术中的冰晶损伤，冷冻蚀刻技术中常见的人工损伤与假象等论文，从而使冷冻蚀刻法的操作成功率进一步提高，使其技术应用进一步趋向成熟。此外，根据生物样品的不同特点，特别是针对一些微小的生物样品(例如：细菌、游离细胞等)，中国学者创建了特殊样品的冷冻蚀刻法，先后发表了游离细胞冷冻蚀刻技术，细菌的冷冻蚀刻技术及其图象的识别等论文，从而更加丰富和发展了冷冻蚀刻技术及其所观察的内容。

关于冷冻蚀刻法的技术应用，国内外学者亦开展了大量工作。在生物膜结构学说方面，1974年辛格(S．J．Singer)等，利用冷冻蚀刻技术在证明生物膜液态嵌模型学说方面，进行了广泛研究工作；1975年胡伯特(F．Humbert)等在复型膜所显示的镶嵌蛋白质微粒大小及其形态等问题上，发表了学术论文；1975年丹尼尔(B．Faniel)等，又在冷冻蚀刻劈裂面的命名方面提出了自己的看法，使现在对此问题有了比较统一的认识，即将膜的疏水后层面向胞质、核质、细胞器基质的面称为EF面，把面向细胞间隙、内间隙的面称为PF面。

在器官与组织学方面，1974年伊藤(S．Ito)等，利用冷冻蚀刻技术对消化系统进行了详尽研究，提出了微绒毛EF面微粒少而平滑，PE面为凹面的看法；当年史劳德(P．claude)等，在研究肾小体的冷冻蚀刻图象中，发现球内系膜细胞突起附着于内皮细胞之外，其细胞间隙连接较多，故有调节肾小体面流量的作用；1976年砂田行(I．Sadayuki)等利用该技术所进行的呼吸系统研究中，证明Ⅰ型上皮、毛细血管内皮上都只有紧密连接，1983年马山斯基(V．F．Mashansky)等，对表皮及其他复层扁平上皮内的细胞连接进行了研究，认为桥粒是其主要连接装置。在细胞学研究方面，1975年斯维尔(N．J．Severs)等，对核膜所作的冷冻蚀刻电镜观察中，发现核膜的壁裂面可出现较其他膜结构更为复杂的情况，核孔可出现多种多样的图象；1978年郎格(R．D．A．Lang)利用该方法对线粒体进行了研究，认为线粒体在体外培养情况下，在培养基中加入不同离子右改变其通透性，从而使线粒体基质的体积得以改变。在中国，1979年雷建章等，总结了国外利用冷冻蚀刻技术开展的细胞超微结构研究工作，发表了《冷冻蚀刻技术在超微结构研究中的应用》论文；1981年应国华等利用该技术对胃癌和乳癌细胞进行了观察研究，发现胃癌细胞膜间隙连接减少，紧密连接走行曲折复杂；1981年王促涛等，对胎儿肾脏的冷冻复型观察中，证明了14周胎儿肾小管上皮细胞质膜平直无镶嵌连接，但有较为复杂的紧密连接；1982年汪德耀等，对北京鸭精子发生过程中膜结构的变化情况，作了冷冻复型电镜观察；宁爱兰等利用该技术，进行了维生素A对Eca109食管癌上皮细胞株作用的研究，1984年张朝佑等，利用冷冻蚀刻法作了犬心肌窦房结细胞膜结构的观察；1985年袁德霞等，又开展了针刺足三里对甲状腺影响的冷冻蚀刻电镜观察；1986年曾弥白等，观察到细胞紧密连按的形成，是由一个自侧膜向顶侧膜移动的极性化过程；1991年陈细法等，进行了纤毛细胞特化结构的冷冻蚀刻研究。

为了更好发挥冷冻蚀刻技术在生物膜研究中的作用，针对目前该技术存在的某些问题，近几年在仪器性能方面，进行了以下改进和提高：(1)努力提高仪器的真空度，由原来的1×10^－5托，提高到1×10^－7～1×10^－9；(2)准确控制切断、蚀刻时样品的温度；(3)将盲目、随机切断，改为选择、定位切断；(4)尽量减少投影喷镀及复型膜的厚度。经过上述改进的专用型冷冻蚀刻装置制出的复型膜，具有反差适当、层次分明、分辩率高等特点，而且可使实验成功率大为提高。此外，为了观察生物结构在实验研究中动力学变化情况，急待开发冷冻蚀刻法与放射自显影、细胞化学、免疫电镜等相结合的技术方法，以得到膜内微粒，如：酶、蛋白、抗原和受体等的动态变化信息。

。【参考文献】：

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3 赤堀宏．冻结试料处理装置的开发．日本电子显微镜学会第35回学术讲演会演预稿集，1979，(35)∶174

4 李文镇，等．冷冻蚀刻技术初步实验成果．医学研究通讯，1979，1(1)∶32～34

5 应国华，等．冷冻复型电镜技术．中华物理医学杂志，1979，1(1)∶28～31

6 雷建章，等．冷冻复型技术在超微结构研究中的应用．中华物理医学杂志，1979，1(2)∶91～94

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8 应国华，等．胃癌细胞のべ－之くぺか法ぃすち超微构造の观察．日本医床电子显微镜学会志，1980，13(3，4)∶255～260

9 李文镇，主编．组织细胞冷冻复型图谱．北京：人民卫生出版社，1981

10 李文镇，等．冷冻复型技术经验介绍和国外进展．电子显微学报，1982，1(2)∶16～19

(河北医学院电镜中心应国华撰；李文镇审)