生物大分子印渍技术

出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第884页（3427字）

把电泳分离后的生物大分子区带通过电或非电动力转移于固定化载体纸或膜上使之固定化，用亲和结合技术一次或多次性地专一检出感兴趣的生物分子，这种技术称生物大分子印渍技术。

1975年，苏格兰爱丁堡大学E．M．Southern首创生物大分子印渍技术。他把限制性内切酶作用后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，然后把已分离开的全部DNA区带通过毛细作用力转移到硝酸纤维素滤纸上，使各区带以非共价连接于滤纸而被固定化；再用经放射性标记的RNA作探针，对所得到的转移DNA谱进行DNA－RNA分子杂交反应，从而检出所需的DNA片段。由于这种转移过程类似于用吸水纸去吸干墨迹，使纸染上墨渍，故Southern称之为Blotting(印渍术或印迹术)。Southern印渍术以后亦称南部印渍术(因Southern含“南部的”之意)或DNA印渍术。

没过一年，法国Chambon小组用Southren印渍术研究鸡胚卵清蛋白基因时，发现了真核生物的基因有不编码的插入序列。这一杰出成果被创立DNA双螺旋模型的Crick誉之为分子遗传学中的一次“微型革命”。

1977年，Alwine等人将此术应用于RNA的研究，并首先采用重氮苄氧甲基纤维素纸，由此提出北部印渍术(Northern blotting)。1979年，Towbin等人又把印渍术用于抗原检出，提出免疫印渍术(Immunoblotting)，以后这种免疫印渍术发展极快，取得许多研究成果。

1981年，Burnette把免疫印渍术称为西部印渍术(Western blotting)。Towbin等人还创造性地使用电洗脱装置作为印渍动力，这不仅能真实地获得凝胶分离区带的复制品，而且也缩短了印渍时间。这种以电作为印渍动力的印渍术，也被称为电印渍(Electroblottiing)、电洗脱法(Electroelution)、电转移(Eletrotransfetr)、电泳转移(Electrophoretic transfer)、横向电泳(Transversal electrophoresis)等。1982年，Reinhart等人将等电聚焦法分离蛋白质的凝胶作为印渍模板，创造了双向印渍术，此被称为东部印渍术(Eastern blotting)，即为蛋白质印渍术。

在这种情况下，1983年Gershoni和Palade提出，印渍术不要以地区来命名，这一术语应和有关大分子合在一起使用，如DNA印渍术、RNA印渍术、蛋白质印渍术等等。这样，以后又出现了许多名称的印渍术，如大分子印渍术、酶印渍术、脂多糖印渍术、配体印渍术、酶联免疫电转移印渍技术、麦胚凝集素印渍术、金印渍术、过氧物酶免疫印渍术等等。其中有以欲检出的大分子命名的，也有以配体或染料命名的。

值得一提的是还有一种点印渍术，其特点是不经凝胶电泳分离，直接把样品以小圆点或其他几何形状(如小方块)点于固定化材料上，然后用分子亲和技术检出。这就是说，这种技术除不经过凝胶电泳外，其它步骤和印渍术相同，故一般把点印渍术作为印渍术的一个分支。

生物大分子印渍术一般包括凝胶、电泳、印渍、印盖和检出等5个步骤。

根据各步骤中不同的反应体系，还需增加不同的平衡洗涤过程。实际上，印渍术是把凝胶电泳技术、固定化技术以及分子亲和结合技术三者融为一体的一项综合性技术。

其核心是把凝胶电泳已分离的区带转移和固定于薄的固定化纸上，并浓集于表面。这也就是将原来难以多次应用、难以作大分子复性处理和难以长期贮藏的凝胶改为可以承受种种处理、能多次应用又能长期贮藏的固定化纸。

与凝胶相比，用固定化纸有以下的优越性：(1)湿的固定化纸是柔韧的，容易操作，绝不像凝胶那样易破裂、易变形。(2)被固定在固定化纸表面上的生物大分子，可以均等地和各种作为探针的配体接近，不会因凝胶孔径的位阻而使其些大分子配体不能进入凝胶产生亲和结合。

(3)由于大分子被浓集于固定化纸表面，因此其后的鉴定通常只需用少量试剂(4)去除变性剂也比直接使用凝胶容易和彻底，能使生物大分子较完全地恢复到天然态。(5)对免疫印渍术而言，由于抗原已被固定化于印渍纸上，故可检出那些不会产生沉淀反应的抗原－抗体反应。(6)加工处理固定化纸的时间大为减少。

(7)现在已能把一块凝胶同时转移到多张固定化纸上，使之进行多种鉴定分析。(8)固定化纸上的区带可以长期贮藏。由于区带较牢固地连接于固定化纸，经得起各种处理，可以连续分析。

(9)探针与区带是非共价结合，故可被“抹掉”，再进行第2、第3探针的检验。(10)对同位素检出法而言，由于固定化纸很薄，可以提高放射自显影的效率；尤其是低能量射线，也能通过印渍术而获得较满意的结果。

目前，印渍术已在以下几个领域得以广泛应用。

(1)在免疫学领域的应用。印渍术是一种既快速又灵敏的筛选抗原抗血清的技术，和其他类似技术相比，它不需要预先提纯，不需要对抗原或抗体进行标记，可以直接用稀释过的抗血清得到免疫复合物。因此，免疫印渍术常被用于描述抗原特性，用于血清学上甄别目的；鉴定抗体特异性；制备表位谱，分析非抗体配体类对其受体的特异性结合；鉴定肿瘤相关抗原；检出免疫学上起交叉反应的蛋白质的电泳变异型，包括补体Clg、次黄嘌呤核糖基转移酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶以及低密度脂蛋白受体。

印渍术还能分析那些溶解度差、而在其它抗原－抗体沉淀反应中常以污染物出现的那些抗原。总之，印渍术最广泛地应用于免疫学和医学临床检验。

(2)在分子生物学领域的应用。最初，Southern用印渍术研究rRNA的基因编码。以后，Chambon小组又应用此技术研究鸡胚卵清蛋白基因，发现“真核生物基因具有不编码的插入序列”。印渍术还在分析DNA甲基化对基因表达关系中，发现甲基化程度和DNA的转录活性成反比。

另外，印渍术还可用于检验和比较机体不同组织或不同发育阶段某些基因的特性；用于各种遗传疾病中功能畸变基因的分析。(3)在生物化学领域的应用。

印渍术被广泛用于研究生物分子间的相互作用。例如DNA－蛋白质和RNA－蛋白质的相互作用；组蛋白H₂、H₃、和H₄之间的相互作用；外源凝集素与糖蛋白之间的相互作用；Gorelick等人用印渍术查证了钙调蛋白与其结合蛋白间的缔合。此外，印渍术也在酶单位的鉴定中发挥作用，甚至有人用印渍术测定酶活性；印渍术还能鉴定质膜的表面成分及其拓扑学、分析同工酶等。(4)在细胞生物学中的应用，由Hayman等人对正常鼠肾细胞(NRK细胞株)进行分析，发现正常的NRK细胞被定位于纤维粘连蛋白和一种新发现的分子量为70kd的多肽上。

(5)在植物生理学中的应用Steup等人用印渍术发现了菠菜和豌豆叶抽提液中葡聚糖水解酶类的多态性。(6)在生物物理学方面的应用。

Erickson等人发现把¹⁴C－或³⁵S－标记多肽从凝胶转移于固定化纸上，能提高用放射性自显影检出的效率。

印渍术从发现至今只不过十几年，但发展迅速，研究成果显着，已为世人重视。

随着技术的不断改进，材料、设备的不断丰富、完善，印渍术将会显出更强的生命力。

【参考文献】：

1 Southern E M．J Mol Biol，1975，98∶503～517

2 Smith G E，et al．Biochem，1980，109∶123～129

3 Bowen B，et al．Nucl．Acids Res，1980，8∶1～20

4 Gershoni J M．et al．Anal Biochem，1983，131∶1～15

5 北京大学生物系遗传教研室编．遗传学实验方法和技术．北京：北京高等教育出版社，1984

6 范培昌．生物大分子印渍技术和应用．上海：上海科技文献出版社，1989

(华东师范大学李世昌副教授撰)