木本植物基因工程研究
出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第977页（4885字）
自80年代初美国首次通过基因工程手段培育出抗卡那霉素的烟草植株以来，至今已有近40种转基因植物问世。
它们当中绝大多数是草本农作物，如烟草、大豆、棉花、蕃茄等，而木本植物的例子十分少见。和草本植物相比，木本植物具有多年生的显着特征，这一性质极大地妨碍了木本植物传统育种工作的开展。而基因工程的应用能大大缩短育种周期，从提高育种效率的角度看，基因工程对于木本植物遗传改良的意义更为重大。不管是草本或是木本，植物基因工程研究的开展主要包括以下方面，(1)基因克隆、序列分析及基因调控机制等方面的分子遗传学基础研究；(2)基因转移、细胞转化技术体系的构建；(3)细胞培养和再分化技术的研究。
木本植物基因工程研究进展
1．基因克隆及基因调控机制的研究。木本植物分子遗传学基础研究方面的进展明显落后于草本植物。在木本植物中，迄今已被克隆并阐明了碱基序列的基因总数不超过20个，主要有与光合作用有关的基因、外凝集素基因以及与植物保护反应有关的基因等。(1)与光合作用有关的基因。
在木本植物基因表达调控的研究中，一个重要的发现是松属树木等裸子植物的一些光合作用关连基因不受光的调控。聚光性叶绿素蛋白基因(cab)和核酮糖二磷酸羧化酶小亚基基因(rbcS)是位于核DNA中的同光合作用有关的两个基因。
在被子植物中，这两种基因的表达受光的调控，在光照下表达(合成有关蛋白质或酶)，一旦转入黑暗中，表达立即停止。而在裸子植物的松树中则不是如此，黑松、欧洲赤松和花旗松的cab基因和rbcS基因在黑暗中也能同样高水平地表达。
烟草、水稻等草本农作物的叶绿体DNA的全部基因序列已被阐明。有关木本植物的叶绿体DNA至今只从针叶树中克隆出了4个基因，即：花旗松和黑松的rbcL(核酮糖二磷酸羧化酶大亚基基因)；山地松的psbA(光系统Ⅱ的D1蛋白基因)、gidA(叶绿素合成基因)和fixC(叶绿素合成基因)。已经知道，被子植物的rbcL和psbA基因受光的调控。但对黑松叶绿体DNA的研究表明，其rbcL和psbA基因的表达同前述核DNA中的cab基因一样，是不受光照调控的，在黑暗中能同样表达。fixC和gidA是最早发现于原核生物绿藻和苔藓植物地钱叶绿体DNA中的基因，它们同黑暗状态下的叶绿素合成有关。1991年，Lidholm等首次从针叶树(山地松)叶绿体DNA中发现并克隆出了这两个基因，其它研究者在云杉和银杏等裸子植物的叶绿体DNA中发现了类似的碱基序列。
但在被子植物的叶绿体DNA中，迄今尚未发现类似序列，fixC基因和gidA基因在针叶树中的发现为阐明裸子植物光合作用基因调控机制提供了一个重要线索。针叶树叶绿体DNA的遗传方式及结构也有很多特殊点。已研究过的草本植物叶绿体DNA都是母系遗传。
但DNA限制性片断多态性分析和种间杂交的结果表明，针叶树叶绿体DNA是父系遗传的，这一点已在花旗松、松及云杉等树种中得到了证明。
被子植物的叶绿体DNA长度为135～160kbp，通常含有一组反向排列的携带有核糖体RNA基因的重复序列。但在花旗松和火炬松的叶绿体DNA中不存在这一反向重复序列，因此其长度较短，仅为120kbp。
(2)其它基因。人们早就发现昆虫危害或其它机械损伤能诱导马铃薯、蕃茄等草本植物体内某些基因(损伤激活基因)的表达，合成出能干扰昆虫消化功能的胰蛋白酶抑制多肽。
在木本植物杨树中也发现了类似的基因调控现象。
从杨树中克隆出了损伤激活基因的cDNA，通过对其进行测序得知其表达产物之一类似于大豆的胰蛋白酶抑制多肽，另一种表达产物类似于壳多糖酶。在杨树木质部的贮存蛋白中，通过对其cDNA序列的分析，也发现了与壳多糖酶同源的氨基酸序列。能凝集动物红血球的蛋白质－外凝集素(lectin)常见于草本植物的种子中。
在木本植物的接骨木、刺槐和国槐树皮韧皮部中也发现了外凝集素的积累，其积累量呈现季节性变化：秋冬季大量形成，春季消失。外凝集素基因的这种表达调控方式被认为可能同自然界的光周期有关。
吉田等(1992)从刺槐中克隆出了外凝集素的cDNA并测定了其碱基序列。
2．木本植物的细胞转化研究。(1)Ti质粒介导的细胞转化。Ti质粒是致瘤农杆菌(细菌)中独立于核DNA之外的小分子环状DNA。
在致瘤农杆菌侵染植物的过程中，Ti质粒中的一段DNA(T－DNA)能够转移到寄主植物核DNA中并得到表达。将希望导入的外源基因插入T－DNA区段，然后借助致瘤农杆的侵染作用即能实现植物细胞的转化。Ti质粒介导转化法在应用上的一个局限性是对于非致瘤农杆菌寄主植物难以奏效。
致瘤农杆菌的寄主主要限于被子植物中的双子叶植物，而单子叶植物和裸子植物(针叶树等)对此菌的侵染不敏感。
木本双子叶植物的杨树是致瘤农杆菌的主要寄主之一，Ti质粒介导的细胞转化技术已在杨树的基因工程中得到了富有成效的应用(实例后述)。由于针叶树对致瘤农杆菌不敏感，所以在植物基因工程开展的早期，一般认为Ti质粒介导的细胞转化不适用于针叶树。Pythoud等(1987)详细研究了致瘤农杆菌对针叶树细胞的侵染过程，发现虽然被侵染部位不一定被诱导出明显的肿瘤，但Ti质粒上的部分DNA片断是可以转移到针叶树细胞中去的。这一发现说明Ti质粒介导法也是适用于针叶树的细胞转化的。(2)DNA直接转移。此法是把纯化的外源DNA直接引入受体细胞，理论上对任何植物的细胞都能适用，从而避免了Ti质粒介导法在适用植物种类上的局限性。
DNA直接转移技术目前主要有电穿孔法、PEG诱导法和基因枪法，其中前两种方法需要将受体细胞经脱壁处理制备成原生质体，而基因枪法可直接运用于有壁细胞。通过基因枪法已成功地将来自昆虫的荧光素酶基因导入了花旗松细胞，将Bt基因导入了杨树细胞，将卡那霉素基因导入了美国鹅掌楸细胞，其中后两种树种从转化细胞分化出了转基因植株。
3．向木本植物导入的外源基因和转基因植株的获得状况。在植物基因工程研究中，将外源基因导入植物并获得转基因植株的目的是：(1)探讨植物基因调控机理，充实发展植物分子遗传学基础理论；(2)对受体植物进行遗传改良，获得新品种为生产实践服务。根据上述目的，迄今为止向植物导入的外源基因可以分成两类，一类为标志基因，用于跟踪探讨基因调控规律，同时还用来作为筛选鉴定已转化细胞的标志；另一类为目的基因，也即符合遗传改良目的的基因。
标志基因的表达产物容易检测，便于追踪基因的表达过程和筛选被转化细胞。已被导入木本植物的标记基因主要有：NPT(新霉素磷酸转移酶)基因，能使受体细胞获得卡那霉素抗性，从而便于筛选转化细胞；GUS(葡萄糖醛酸酶)基因和nos(胭脂碱合成酶)基因，分别赋予受体细胞以葡萄糖醛酸酶和胭脂碱合成能力，便于检测基因的表达；CAT(氯霉素乙酰转移酶)基因，能赋予氯霉素抗性，便于转化细胞的筛选。这些基因都来自细菌(大肠杆菌或致瘤农杆菌)。其它还有来自昆虫的虫荧光素酶基因，其表达产物在虫荧光素存在下可发出荧光。目前以遗传改良为目的而导入木本植物的基因有：来自沙门氏细菌的aroA基因和来自放线菌的bar基因，两者都能使受体植物获得对除草剂的抗性；来自苏云金杆菌的Bt基因和来自马铃薯的蛋白酶抑制多肽基因(pin2)，能赋予或增强受体植物的抗虫性或对机械损伤的保护反应能力。已被导入了某些标志基因的木本植物目前已有近20种，其中针叶树有花旗松、云杉、落叶松和火炬松，其余都是被子植物。
对针叶树导入基因后只获得了细胞或愈伤组织水平上的短暂表达，而由转化细胞分化出完整转基因植株的实例目前只有杨树(3种)、核桃、苹果、鹅掌楸和猕猴桃，它们无一例外都是被子植物。
在这些木本被子植物中，只有杨树获得了具遗传改良意义的转基因植株。通过Ti质粒介导法已分别把aroA基因和bar基因(de Block．1990)导入了杨树，获得了具除草剂抗性的转基因植株；通过基因枪法把Bt基因导入了杨树，获得了抗虫植株。
木本植物基因工程的存在问题
1．有利于遗传改良的外源基因来源贫乏。目前，向木本植物导入的为数不多的基因多属标志基因，没有实际的育种价值。
已导入的极少数具遗传改良意义的基因，也同标志基因一样，大都是来源于细菌(或放线菌)的控制单一性状的简单基因。
由于木本植物自身的特点和人类经济活动的需要，对木本植物需要赋予的性状要比对草本农作物的更趋复杂和多样化，它们大都是多基因控制的性状，如木材性质、树干通直性、纤维素含量、耐瘠薄性、耐风沙或抗干旱性等。
很明显，如此复杂而多样化的性状表达仅靠细菌提供基因是难以满足的。木本植物的驯化程度低，遗传多样性远比草本的栽培农作物复杂，其自身就是一个丰富多彩的基因库，有待于开发利用。
但这又有待于木本植物的基因定位、克隆、测序等基础研究的深入开展，而目前有关木本植物分子生物学方面的基础研究是非常薄弱的。
2．细胞培养和分化诱导技术有待突破。80年代以来，以Ti质粒介导法为中心的各种DNA转移技术发展很快。
对于木本植物的基因工程来说，目前实现细胞转化已不是难题，最大的问题在于如何使已转化细胞分化成完整植株。目前除杨树及少数果树以外的大多数木本植物尤其是针叶树的细胞培养技术还极不完善，从体细胞诱导再生植株还十分困难。迄今为止未能获得针叶树转基因植株的主要原因不在于细胞转化技术，而在于无法将转化的细胞诱导成完整植株。
细胞分化诱导技术的建立已成为决定木本植物基因工程能否广泛开展并走向实用化的关键环节之一。
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(东北林业大学林学系程东升教授撰)