大麦醇溶蛋白
出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第1025页（5640字）
根据Oshorne溶解度分类法，大麦胚乳蛋白可分成清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。
其中醇溶蛋白占总蛋白的40%～60%，是种子蛋白的重要组成部分。然而无论从必需氨基酸含量还是从氨基酸平衡看，醇溶蛋白都不理想，致使大麦营养价值偏低，影响人畜利用。因而人们对醇溶蛋白进行了许多方面的研究，包括蛋白的组成、结构及利用多态性进行品种鉴定，基因定位和遗传，蛋白质体和发育中醇溶蛋白积累，高赖氨酸突变体及与醇溶蛋白的关系等。
醇溶蛋白的组成、结构和多态性 大麦醇溶蛋白由氨基酸组成，分子量等分为A、B、C、D4组。
A组醇溶蛋白，占总醇溶蛋白含量的1%～2%，分子量为20000000以下，等电点pI5．5～7．0，含有比B组、C组多肽明显低的谷氨酰胺、脯氨酸和相对高的赖氨酸，表现很小或几乎没有遗传变异，并且很有可能不存在于蛋白质体，因此一般倾向于认为A组多肽不是醇溶蛋白。
B组醇溶蛋白，是大麦醇溶蛋白的重要组成之一，占总醇溶蛋白的70%～90%。分子量据不同测定方法有所不一，用电泳法为35000000～46000000，用平衡超速离心为32000000～35000000。等电点pI6．0～8．0。富含谷氨酰胺、谷氨酸(Gln+Glu35．4摩尔百分数)、脯氨酸(20．6摩尔百分数)，但比C组醇溶蛋白略低一筹；必需氨基酸、碱性氨基酸和碱性氨基酸缺乏；较特殊的是相对富含硫氨基酸(半胱氨酸2．5摩尔百分数)，致使B组醇溶蛋白多肽部分以单体、部分通过二硫键以聚合体形式存在于生物体。关于B组醇溶蛋白末端氨基酸的研究远落后用羧肽酶Y水解法测定C－端，认为C2多肽可能有两类，即－Val－SerCOOH。
关于C醇溶蛋白二级结构，不少人认为是β－折叠，没有α－螺旋和β－片层，是由于脯氨酸的存在，在N－端每隔2、3、4个残基就出现1次脯氨酸，而形成α－螺旋或β－片层的最小残基数分别为5、6。
D组醇溶蛋白，占总醇溶蛋白2%～4%，分子量为100000000以上，P18．0左右，含有较多甘氨酸。
品种间变异很小，单向电泳仅具一条带，但双向电泳或其为他高分辨率方法表明它包含若干等电点不同的多肽，并可能以聚合的形式存在于生物体。
众多证据表明B组醇溶蛋白和C组醇溶蛋白有极明显的多态性，B组至少三四十个多肽，C组至少有一二十个多肽，每种多肽在品种和地理上的分布有差异，同一组内各多肽分子量、等电点等不同，却有相似的氨基酸组成和末端氨基酸序列。对这些现象目前一般认为编码B组醇溶蛋白、C组醇溶蛋白的Hor2、Horl位点是多基因簇，由一原始基因经重复、趋异形成的紧密连锁基因群。
由于醇溶蛋白不承担重要生理功能，可以忍受较多突变，故有明显的多态性。
点突变、缺失和／或插入可能对多态性起作用，除了造成等电点和溴化氰断裂型改变外，后者通过不对等交换或对错误配对DNA的修正，改变了多肽分子量。这些趋异途径也可解释同组多肽有不同的等电点和分子量却有相似的末端氨基酸序列。
有研究资料表明，组内各多肽在序同源程度上表现出差异，这可能暗示重复、趋异是在长时期内分几次发生的。可能由于检测方法限制和等位基因剂量效应干扰，Horl、Hor2、Hor3位点内部未见重组报道，而这种重组在决定不同多肽在现代大麦系列中的分布可能起了重要作用。
醇溶蛋白基因定位及遗传 醇溶蛋白各组多肽基因及定位长期以来颇受重视。
一致认为Horl、Hor2、Hor3位于第5染色体。其中较完整的连锁图由Jensen和Shewry提出。二者结果基本相似，但Horl－Rps4间图距相去甚远，分别为1．5cm和15．9cm，原因不明。
Shewry认为Minn与Hor3、H、Rps不连锁，但Jensen以为Mlnn与necl间有松散连锁(36．8±4．2)；现有倾向认为Mlnn可能并不真正位于第5染色体，有待进一步证明。另据报道，抗白粉病基因Mlao、Mile与Horl、Hor2连锁。
Hor1、Hor2间距0．161+0．026cm，Mla位于之间，跟Hor1、Hor2间距+0．064±0．020和0．082±0．24。Hor1、Hor2和Mla、Mlle的紧缩密联锁，客观上造成某些抗白粉病基因与特定醇溶蛋白等位基因联合；在一些情况下，育种时引进抗白粉基因，同时也就把某些醇溶蛋白等位基因引进来。
这一连锁，意味着醇溶蛋白分析可作为抗白粉病育种的初级检测。从杂交子二代分离看，Hor1、Hor2、Hor3均为1∶2∶1(P＞0．05)，表明是共显性遗传。
比较大麦醇溶蛋白基因位置与相应基因在小麦上的位置很有意义。小麦高分量型蛋白(HMW)由等位基因Glu1编码，位于第1同源染色体长臂，距着丝粒9cm。
大麦第5染色体着丝粒可能位于fs2的短臂端，这样，Hor3距着丝粒大约也是9cm。小麦W－型醇溶蛋白与C组醇溶蛋白同源，由Gli1编码，在第1染色体短臂，距Glu1 66cm，与Hor1和Hor3的间距(64．8±3．3cm)很接近。小麦r－型醇溶蛋白与B组醇溶蛋白多肽氨基酸组成相似，由Gli1编码；这样，小麦Gli1可能对应于大麦的Hor1和Hor2。小麦醇溶蛋白基因Gli2在第6同源染色体短臂。
利用醇溶蛋白多态性进行品种鉴定 不同种与品种醇溶蛋白并不完全相同，构成了差异。由于多肽是基因产物，因而特征多肽是相对稳定的；虽然环境因子可能影响蛋白含量，但特征多肽的有无全然不受影响，这样，醇溶蛋白就成为品种的标记或“指纹”，广泛应用于品种或种的鉴定。分离各醇溶蛋白多肽的方法有电泳，包括早期使用的淀粉凝胶电泳(SGE)、尿素－聚丙燃酰胺凝胶电泳和目前广为使用的十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、等电聚焦凝胶电泳(LEF)及双向电泳。随着生物技术的不断更新，目前多采用高效液相柱层析，其中用得最多的是反向高效液相柱层析(RP-HPLC)，不仅加快了分析速度。
结果还可自动分类，鉴别出一些电泳无法甄别的相似品种。Bateg提出的离子交换柱层析也可快速而精确地分离多肽，而所需设备比较简单。Deich1和Donhauser发展了定量免疫法，即以醇溶蛋白多肽为抗原的抗原抗体反应，可以定量、检测到一些不易区分的品种，并且构建的单克隆抗体有可能允许在短时期内检测大量样品。如果说上述方法是以多肽为目标，那么Burt和Rivin提出的方法是直接对准基因。他们以醇溶蛋白基因DNA限制性酶切片段长度的多态性为指纹，即以DNA限制性核酸内切酶(Hind Ⅲ和Eco R1)酶切Hor1、Hor2、Hor3，再通过吸印转移法，用C组醇溶蛋白、B组醇溶蛋白、D组醇溶蛋白cDNA克隆与酶切片段杂交，差异表现为杂交片段数目和／或电泳迁移率不同，达到鉴定目的。
蛋白质体和发育中醇溶蛋白积累 1981年，Miflin指出，大麦醇溶蛋白在粗糙内质网合成并聚集成团，然后从内质网破出，形成不规则沉淀体(蛋白质体)，其表面没有完整的膜，但有许多小泡，并与粗糙内质网仍有粘连。
据Rahman观察，大麦受精后胚乳发育远比胚早，14a胚乳液状体，18a电泳检测不到特征带型，但此后醇溶蛋白合成迅速增加，20a胚乳达干重的40%，可见电泳带型，22a胚乳已达干重的60%。在发育过程中，幼小胚乳时C组醇溶蛋白达到高峰，约占总醇溶蛋白的20%，但渐减至26a的14%，并稳定下来；相应观察到B1的增加，从幼小组织的30%到成熟种子的50%。
由此可见，Hor2、Hor1的表达是有差异的。另外，若硫成为限制因子，也将导致B组、C组比例的改变，因为合成B组醇溶蛋白需要含硫氨基酸，而C组肽几乎不含半胱氨酸，籽粒发育过程中的A组醇溶蛋白的相对量也渐减。值得注意的是组内各多肽积累速率也有差异如B组醇溶蛋白、B1相对增加，而这种增加不可能是其他B组分转化造成的。
因为一方面从溴化氰切带型看，B1有两个高等电点多肽，它们与B2、B3的多肽明显不同；另一方面，检测到mRNA的变化与之吻合，cDNA克隆杂交也证明之。
这意味着同一复合基因簇的表达有所不同，而这一基因簇很可能受律动调节。但也有人认为这是由于mRNA稳定性不同造成的。
大麦高赖氨酸突变体及其与醇溶蛋白的关系 最初，人们在玉米中发现高赖氨酸突变体，随后在大麦、高梁等作物中也陆续发现。大麦有18种突变体或系列，对其中部分进行了遗传分析和基因定位，主要涉及的染色体有第1、5、6、7号。
RisΦB3有影响但小于前者。在相关的mRNA上也看到了这种表象。值得注意的是RisΦ1508中并未发现Hor2位点的严重缺失(对比RisΦ56)。B1和B3的相对比例也受另两个突变基因的影响，它们是RisΦ13第6染色体上的lyf5f和RisΦ7的未定位高赖氨酸突变基因。
所有这些突变基因可以认为是调节者，可位于也可不位于第5染色体。这些基因可能还存在多效效应。
Kreis等研究了RirΦ56后认为，其醇溶蛋白量比通常的品种降低30%，其中B组醇溶蛋白减少3／4，C组醇溶蛋白增加一倍多，D组醇溶蛋白没变化。电泳表明并非所有的B组醇溶蛋白多肽受到同样影响，一些在亲本是主要的条带消失了，而较弱带却大大地加强。
从发育胚乳提取Poly(A+)RNA体外合成多肽，发现缺少合成B组醇溶蛋白主要多肽的mRNA而有合成次要多肽的mRNA，后者的量大为提高；有非常多的C组多肽的mRNA，分子克隆杂交也显示缺少与B组醇溶蛋白相关克隆杂交的Poly(A+)RNA而含有与C组醇溶蛋白相关克隆杂交者。进一步从发育中的Corlsberg(RisΦ56亲本)和RisΦ56提取DNA，以限制性核酸内切酶Hind Ⅲ消化，用电泳分离片段并转移到硝化纤维膜，再与32P标记的克隆PC179(与B相关)DNA杂交，Carlsberg Ⅱ有11个残基片段能杂并，每个单倍体基因组至少有13个与B组醇溶蛋白有关的基因拷贝，而RisΦ56可杂交的仅2个Hind Ⅲ酶切片段(24kg．76kd)。
遗传分析表明RisΦ56突变位点在Hor2，估计Hor2的缺失片段至少约9个。与亲本比较，没有证据表明RisΦ56的B组醇溶蛋白基因序列发生重组或改变；发育过程中也无基因放大，因而不太可能是放大机理变异造成的改变。
上两例高赖氨酸突变体虽然最终都表现为醇溶蛋白减少，赖氨酸含量增加，但机理完全不同。
醇溶蛋白基因位点是紧密连锁的基因群，在杂交时很少发生基因内重组，因而想通过杂交从若干系列聚集更多的高赖氨酸醇溶蛋白多肽而得到一高赖氨酸品种似乎是不可能的。目前在大麦中提高赖氨酸育种方法主要有两种，一是通过诱变，使调节基因发生碱基突变，以控制醇溶蛋白合成比例；另一是通过遗传操作，对醇溶蛋白结构基因进行修饰。
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(中国水稻研究所湛小燕撰)