酶法分离胚囊

出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第1030页（2145字）

酶法分离胚囊为进一步研究被子植物的雌配子体开辟了新途径。

酶解法分离出的胚囊，立体感强，保持完好的整体性。此方法操作简单，特别适合于进行大孢子和胚囊发育时期的研究。结合组织化学与细胞生理学研究，可以更深入了解胚囊的生理生化特征，同时还可与正在发展中的遗传操作和生物工程技术相结合，从而开创受精工程的新领域。

1960年，Forbes用酶解法分离雀稗属植物成熟胚囊成功，采用的是酶解涂抹技术，将雀稗属植物的子房酶解、染色后，在解剖镜下手工剖出胚囊进行观察。

此后，国内外对胚囊的酶解给予重视。70年代以来，前苏联萨拉托夫大学的Тырнов、ЕналeeBa等人在这方面开展了大量工作，根据从文献中了解的简略情况，他们已由10科25种植物的固定胚珠材料中分离出完整的胚囊进行显微观察，烟草、列当生活胚囊也已分离成功，并尝试进行离体培养，但未曾报道具体方法。前苏联研究者多用自制的蜗牛胃液酶辅以果胶酶。

在中国，近年来许多研究者也已试验成功。从现有资料看，Eналeeвa等和中国研究者的方法虽然不尽相同，但在酶解与机械振荡相结合，不用徒手解剖方法分离胚囊这一点是一致的。

此法可以同时制备大批材料，尤其适于分离体积小或较为幼期的材料。1982年，周嫦、杨弘远用果胶酶与纤维素酶的混合液由烟草、蚕豆与紫菜苔的胚珠中分离出完整的胚囊，这一实验结果证明酶法分离胚囊是一项切实可行的新技术，具有操作简单、快速，能保持胚囊的完整性以及显微镜观察效果良好等优点。1984年，杨弘远、周嫦又在泡桐与芝麻两种植物上作了更系统的工作，收到肯定效果，表明这一技术特别适用于多胚珠材料大孢子发生时期的快速鉴定。

此外，如欲进行显微光度测定，采用未切破的整体细胞也是有利的。接着，周嫦、杨弘远在金鱼草上，首先以固定胚珠为材料，分离出受精前特别是受精后不同时期的胚囊，并在此基础上试探分离活的胚囊获得成功。

这个实验有两方面进展，一方面，不仅分离出受精前的胚囊，而且也分离受精后的胚囊(从花粉管进入胚囊直至上百个胚乳细胞时期)；另一方面，不仅由固定材料而且也初步由新鲜胚珠中分离出受精前后的胚囊。1985年，胡适宜等从新鲜烟草胚珠中分离出胚囊细胞的原生质体，包括卵细胞、助细胞、中央细胞和反足细胞的原生质体，这是第一次成功，表明被子植物裸露的雌配子原生质体能被分离，在遗传操作和植物细胞生物工程中的应用，显示出巨大的潜力。

此外，在分离花粉管原生质体方面，他们也已获得初步成功，其中一部分原生质体是含有核的。如能将分离的带雄核的及带雌核的原生质体在体外融合，则这一离体条件下人工控制的融合程序接近自然的受精作用，他们称为受精作用的体外模拟。

由于分离的雌雄性细胞的直接融合，在育种工作中作为组合不同基因组、创造新物种的一种途径，具有独特的价值。

关于酶解胚囊方法，中国学者先后建立起两种酶解分离胚囊的方法，即酶解过程结合连续振荡法和酶解压片法。

1990年，邓秀新等以几种果树为材料，利用酶解方法分离胚囊，获得较好的结果。1991年，邱德勃等用酶解压片技术又成功地分离巴西橡胶树和番木瓜两种热带作物不同时期的胚囊。

酶法分离胚囊是一种探索中的技术，迄今还是不太成熟，存在的问题首先是酶解的效果亦因植物种类、发育时期与组织性质的不同而异，酶解效果不够稳定，容易发生破损或质壁分离，易受胚囊发育时期、酶的种类与浓度、酶液的H+浓度、酶解温度与时间等多种因素的影响。另外，观察方法尚待改进，固定材料经透明与染色后有好的显微观察结果；活胚囊则迄今较难鉴定内部结构。

如何保持离体胚囊的生活力亦有待今后研究。分离的胚囊和胚囊细胞原生质体混杂在大量的体细胞中也难以应用，因此还需要进一步改进分离方法和寻找简便的提纯技术。

用酶解技术分离胚囊，开拓了研究与控制胚囊发育的新前景，可以直接对裸露的活胚囊进行其它方法比较难以进行的组织化学的与细胞生理学的研究，尤其是胚囊内酶的组织化学、细胞渗透压与pH值等生理指标的测定等将会因之改观。

活胚囊的分离是实现胚囊离体培养这一重要目标的必要技术前提。

。【参考文献】：

1 周嫦，等．植物学报，1982，24(5)：403～408

2 杨弘远，等．植物学报，1984，26(4)：355～358

3 周嫦，等．实验生物学报，1984，26(4)：141～146

4 胡适宜，等．植物学报，1985，27(4)：337～344

5 邱德勃，等．植物学报，1991，33(5)：350～355

6 邓秀新，等．果树科学，1990，7(2)：71～74

(东北农学院胡宝忠硕士撰；桂明珠审)