磷－32酶法标记核苷酸

出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第896页（2168字）

遗传工程是依据分子遗传学原理，采用类似工程设计的技术手段，空向的改变生物体的遗传特征的一门生物学技术。

磷－32标记的核苷酸是研究遗传工程的工具。生物工程设计的好坏、空向改变与否都需要参与反应的标记核苷酸来提供科学的依据。

遗传工程的核心就是脱氧核糖核酸，是遗传物质的基础。

因此，自1958～1979年的21年中，曾有多名科学家因对DNA的研究获得诺贝尔奖金，由此说明此项工作的重要性和蓬勃发展的情况。而₃₂P酶标记的高比活度核苷酸主要用于遗传工程研究、DNA缺口翻译标记、末端分析和分子杂交等工作的需要，为了能满足以上需求，³²P标记的核苷酸应具有高比活度，一般要在2000～4000Ci／mmol(74000～148000GBq／mmol)；高比浓度，最高可达8．0～10．0mCi／ml(296－370MBq／m1)；高放化纯度，通过高压液相分析＞98%。其中重要的几种32P酶标记化合物有［γ－³²P］ATP、［γ－³²P］－5′－三磷酸腺苷、三乙胺盐［γ－³²P］Adenosine triphosphate triethylammonium Salt，［a－³²P］ATP、［α－³²P］－5′－三磷酸腺苷、三乙胺盐［α－³²P］Adenosine triphosphate triethylammonium Salt，［α－³²P］dATP、［α－³²P］－5′－三磷酸脱氧腺苷、三乙胺盐［α－³²P］Deoxyadenosine triphosphate triethylammonium Salt，［α－32P］dCTP、［α－³²P］－5′－三磷酸脱氧胞苷、三乙胺盐、［α－³²P］Deoxycytridine triphosphate trithylammonium Salt。

3²P标记核苷酸的方法有化学合成法、化学——酶法和酶法等。由于前两种方法的操作程序长，产额低，产品的比活度低等，满足不了各方面研究的要求。酶法可弥补以上缺点，酶标记核苷酸的方法：

1．［γ－³²P］ATP。1979年，T．F．Walseth等在改进P．E．Schendel等人的方法基础上，用酶法制备了高比活度［γ－³²P］ATP和［a－³²P］ATP。［γ－³²P］ATP的制备是以1－α－甘油磷酸经过1－α－甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸酶、乳酸脱氢酶等一系列酶促转化，在1－α－甘油磷酸转变为3－磷酸时，在3－磷酸甘油酸激酶、甘油醛－3－磷酸脱氢酶的催化下，对底物ADP进行基质水平的磷酸化。通过分子内部能量的重新分配，使分子中原来的低能磷酸键转变为高能键，然后使用ADP，与外源磷－32柱合成［γ－³²P］ATP。

其标记样品可用DEAE-Sephadex A－25柱层析分离或用高压液相制备色谱YWG－R₄NCl柱进行分离，其分离效果更佳。［γ－³²P］ATP的放化纯度可在98%以上，其比活度为4000～5000Ci／mmol(148000～185000GBq／mmol)。

2．［α－³²P］dATP。酶促合成［α－³²P］dATP包括四步连续的酶促反应过程。

首先，以酶法合成高比活度［γ－³²P］ATP作为前体，然后在T₄－多核苷酸激酶作用下，以3－dAMP为底物合成［5′－³²P］－3′－dADP，［5′－³²P］－3′－dADP在核酸酶P₁催化下酶解为［5′－³²P］－dAMP，继而在肌激酶和丙酮酸激酶作用下［5′－³²P］dAMP磷酸化为［α－³²P］dATP。其标记样品同样采用阴离子交换柱DEAE－Sephadex A25分离或用高压液相制备色谱YWGR₄NC1柱进行分离，［α－³²P］dATP的放化纯度可达98%，比活度为3000Ci／mmol(111000GBq／mmo1)，［γ－³²P］ATP的利用率可在90%。

为获得高比活性［α－³²P］dATP，首先要标记高比活性，高放化纯度的［γ－³²P］ATP作为进一步反应的前体。［α－³²P］ATP和［α－³²P］dCTP制备方法类似以上的方法。

。【参考文献】：

1 Schendel P F，et al．J Biol Chem．1973，248∶8319

2 Walseth T F，et al．Biochem Biophys Acta，1979，526∶11

3 Johnson R A，et al．Adrnces in Cyclic Nucleotide Research，1979，10∶153

4 田桂英，等．核化学与放射化学，1986，8(1)∶32

5 何丽明，等．第3次全国核化学与放射化学学术讨论会论文摘要集，1990，4

(中国原子能科学研究院仪明光撰)