聚合酶链反应

出处：按学科分类—医药、卫生 辽宁科学技术出版社《皮肤病性病诊疗手册》第36页（1208字）

〔原理〕

PCR是选择性体外扩增特异脱氧核糖核酸(DNA)片段技术，是一种分子克隆技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异DNA序列的拷贝。DNA片段是一条多聚脱氧核苷酸链。在自然界中DNA是以由氢键连接的两条互补的多核苷酸链而形成双螺旋结构形式存在。复制和转录是DNA的主要功能。PCR技术是在模板DNA(被检标本)、引物(人工合成的寡核苷酸)和4种脱氧核糖核苷酸(dDTP)存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分为三步，(1)变性：通过加热(90℃～95℃)使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；(2)退火：当温度突然降低(25℃～37℃)时，由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA量显着多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。(3)延伸(温度60℃～72℃)：在DNA聚合酶和4种dDTP底物及镁离子存在条件下，以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板。经过高温变性、低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。每循环一次，目的DNA的拷贝数增加一倍。PCR扩增的特异性是由人工合成的一对寡核苷酸引物所决定的。一般样品经30次循环就可在约2小时左右将靶DNA扩增数百万倍。

〔结果〕

将扩增后的产物进行电泳，经溴乙锭染色，在紫外灯照射下如能见到扩增特异性区段的DNA带即为阳性。

〔临床意义〕

PCR是一种快速的特定DNA片段体外扩增技术，一段只需数小时即可检出0．1微克基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列，具有较高的敏感性和特异性，可达到快速诊断的目的。目前已用于多种疾病的诊断或病原体的检测，如感染性疾病，包括病毒感染，如单纯疱疹、人乳头瘤病毒感染、HIV感染等；细菌感染，如淋病、结核、麻风等；螺旋体感染，如梅毒、Lyme病、螺旋体感染等；衣原体和支原体感染；真菌感染，如白色念珠菌等感染。又如遗传性疾病的基因诊断及某些皮肤肿瘤的诊断等。供检查的临床标本有血液、尿、疱液、分泌物、脑脊液、精液、毛发、粘膜上皮及活检标本等。但该项检查的结果易受多种因素影响，如实验室条件、操作者熟练程度、引物质量等，常导致假阳性结果，故应高度重视。开展此项技术，应有比较完善的实验室；可疑结果应重复检查；并设立阳性和阴性对照，必要时需结合临床及其他检查方法的结果，以免造成误差。