仪器和试剂
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《农作物品种鉴定手册》第136页（8715字）
1．仪器
(1)电泳仪 可用北京六一仪器厂制造的DYY-Ⅲ型电泳仪(电压1－600V)，或用江苏丹阳无线电一厂生产的SCR－4型高压电泳仪(电压范围1－1500V)。
(2)电泳槽 可用北京六一仪器厂制造的六一牌夹心式垂直电泳槽。其样品梳为12－18个齿。
(3)离心机 可选用上海安亭仪器厂生产的TGL－16B型高速台式离心机。最高转速为16000转／分。定时1－30分。
(4)离心管 必须采用与离心机配套使用的离心管。通常用1－2ml聚丙烯塑料离心管，用作样品的提取和离心。
(5)样品钳 这是用于夹碎种子的工具。可用轻便老虎钳代替。
(6)其他物品 还需有存放有关试剂的广口瓶，移液管，吸耳球，微量进样器(50μl)、注射器等电泳用品。
2．试剂 所有使用的化学试剂都须是分析纯级或更好的等级。
(1)丙烯酰胺(Acrylamide)
(2)亚甲基丙烯酰胺(Bisacrylamide)
(3)尿素(Urea)
(4)冰醋酸(Glacical aceticacid)
(5)甘氨酸(Glycine)
(6)硫酸亚铁(Ferrous sulphate)
(7)抗坏血酸(Ascorbic acid)
(8)过氧化氢(Hydrogen peroxide)
(9)2－巯基乙醇(2－mercaptoethanol)
(10)甲基绿(Methyl green)酸性指示剂
(11)三氯乙酸(Trichloro acetic acid)
(12)乙醇(Ethanol)
(13)2－氯乙醇(2－Chloroethanol)
(14)考马斯亮蓝R250或G250(Coomassic brilliant blue R250)。
3．溶液的配制
(1)提取液
1)小麦提取液(100ml) 称取甲基绿粉剂0．05g，加入25ml2－氯乙醇，再加入无离子水，定容至100ml。低温保存。
2)大麦提取液(100ml) 称取甲基绿粉剂0．05g，加入20ml 2－氯乙醇，18g尿素，1ml2－巯基乙醇，然后加入无离子水，定容至100ml，低温保存。
(2)电极缓冲液(500ml) 吸取20ml冰醋酸，加入2g甘氨酸，再加入无离子水，定容至500ml，低温保存。使用时再稀释10倍。
(3)凝胶缓冲液(250ml) 吸取冰醋酸5ml，加入0．25g甘氨酸，再加入无离子水，定容至250ml。低温保存。
(4)0．6%过氧化氢液(30ml) 吸取30%过氧化氢原液0．6ml，加无离子水至30ml，装入100ml滴瓶备用。保温保存。
(5)染色液
1)10%三氯醋酸液(500m1) 称取50g三氯醋酸，加入无离子水，定容至500ml。
2)1%考马斯亮蓝液(50m1) 称取0．5g考马斯亮蓝，溶于50ml无水乙醇。
(6)凝胶溶液(200m1) 称取丙烯酰胺20g，亚甲基丙烯酰胺0．8g，尿素12g，抗坏血酸0．2g，硫酸亚铁0．01g，再加入120ml凝胶缓冲液溶解，并用该液定容至200ml，低温保存备用。
4．操作程序
(1)样品醇溶蛋白提取 取若干个清洁干燥的1m1聚丙烯离心管，分别插入合适的试管架圆孔内。分别取小麦或大麦种子样品逐粒用样品钳夹碎。在夹种子时，最好垫上小片清洁的纸，以免清理钳头，防止样品之间污染。每粒夹碎的种子粉块放入一个离心管。真实性鉴定时，每个样品取3－5粒重复；品种纯度测定时，每个样品取50－100粒种子测定。然后加入样品提取液。小麦每管加入0．2m1，大麦每管加入0．3ml提取液，盖好后，适当摇晃，放在室温浸提一夜。加样前用5500转／分离心15分钟。
(2)凝胶玻架封缝 从冰箱内取出凝胶溶液(6)和0．6%过氧化氢液(4)，每块胶板吸取这种凝胶溶液3ml，立即加入0．6%过氧化氢液小半滴，摇匀后迅速倒入封口处，稍加晃动，使整条缝口充满胶液，让其在5－10分钟聚合。但必须注意，灌胶动作应快速，否则会由于太慢，在倒入缝口处前就已开始聚合。
(3)灌制分离胶和插好样品梳 从冰箱内取出凝胶溶液和过氧化氢液。每块胶板吸取凝胶溶液17－18ml，立即加入1滴0．6%过氧化氢液，迅速摇匀，倒入凝胶玻板之间，马上插入样品梳，并用铁夹子夹正，放直，让其在5－10分钟内完全聚合。
(4)加样 在加样前，小心平衡地拔出样品梳，用滤纸吸去多余的水分，然后用微量进样器吸取醇溶蛋白提取液。一般每个样品加样10－20μ1为宜。若加样量太多，会使蛋白质谱带连续而难以分辨，或者加样量太少，会使某种浅带丢失。
(5)电泳 在电泳前，先将电极缓冲液稀释10倍，一般每个电泳槽取80ml电极缓冲原液，加无离子水稀释到800ml，分别注入前槽和后槽。
接好电极引线，前槽接正极，后槽接负极。然后打开电源，逐渐将电压调到500V。电泳时，要求在15－20℃温度下进行。如气温高于这一温度范围时，可放在冰箱内、空调室或接通自来水冷却。电泳时间一般为60－80分钟。其具体电泳时间可按甲基绿迁移时间来推算。如甲基绿前沿指示剂在25－30分钟迁移至胶板底部(10cm左右)，那么醇溶蛋白电泳时间为甲基绿的迁移时间的2－2．5倍，则60－80分钟左右。
(6)固定和染色 在固定和染色前，按每块胶板吸取3．5ml1．0%考马斯亮蓝液，再加上100ml的10%三氯醋酸液，配成染色液。
小心地剥下胶板，切去样品槽部分的胶板，并切去胶板下端一角作为胶板左右边的标记，然后用无离子水漂洗后，浸入染色液里染色1－2天。
(7)保存 倒去染色液，再用清水漂洗，并用湿软毛笔刷去胶板表面的蓝色沉淀，然后用7%醋酸液保存。
也可制成干胶板或装在聚乙烯薄膜袋里在4℃冰箱内保存数个月而不变质。
5．电泳图谱鉴定
(1)真实性鉴定 按电泳胶板蛋白质显色的蓝色谱带，与其该品种标准图谱进行比较，鉴别品种的真伪。
(2)品种纯度测定 按品种标准图谱鉴别出电泳图谱不同的异品种种子粒数，计算出品种纯度百分率。
6．注意事项 为了使电泳工作顺利进行和效果更好，特别应注意下列问题。
(1)在样品醇溶蛋白提取过程中，在取种子时，不能取霉烂变质，蛋白质已变性或分解的种子和病粒，以免造成误检。同时每粒种子夹碎程度或细度应基本一致，以保证各管样品蛋白质含量基本一致。并要求种子含水量基本一致。因为种子愈干燥，则愈易夹碎，那么醇溶蛋白含量就多，反之则少。这就会影响谱带的出现或丢失情况，以及浓淡程度的差异。
此外，每管所加入提取液的量也应基本一致。
(2)凝胶溶液必须保存在冰箱里近零度的温度下，并且存放时间不宜过长，否则会变质而失效。在封缝和灌分离胶时，从吸取胶液，加入过氧化氢溶液，混匀，灌胶，直至插入样品梳等全部过程必须迅速，以免在灌胶前，胶液已开始聚合而失败，浪费胶液和时间。
(3)加样数量应掌握好。一般为10－20μ1，严防加样过多过少。因为加样过多，则谱带相连续，难以分辨；加样过少，则有的谱带可能丢失，均难以保证电泳谱带的清晰。
(4)电泳温度应保持在15－20℃范围内。当室内气温超过这一温度范围时，应放在空调室或冰箱内或接通自来水等措施冷却，以防蛋白质变质，而影响电泳图谱的质量。
(5)该标准电泳程序是利用10%浓度凝胶，胶板较脆，并且在快速聚合时，与玻板粘得较牢，因此在剥胶板时，应尽量小心，以防剥破而前功尽弃。
【参考文献】：
〔1〕颜启传(1984)，杂交水稻及其三系种子的真实性和纯度检验，《种子》1984年第3期第15－18页。
〔2〕颜启传(1984)，应用聚丙烯酰胺凝胶酯酶同工酶垂直板电泳鉴定杂交水稻及其三系种子真实性和纯度，《浙江农业科学》，1984年第4期第196－199页。
〔3〕颜启传(1986)，水稻杂交种及其三系种子鉴定技术的进展，《种子世界》，1986年第8期，第2－3页。
〔4〕颜启传、黄亚军(1986)，杂交玉米吉单101及其亲本自交系种子真实性和纯度测定技术的研究，《种子》，1986年第5期，第12－15页。
〔5〕帅素云等(1983)，用酯酶同工酶分析法鉴定杂交水稻种子纯度，《江苏农业科学》，1983年第9期第16－20页。
〔6〕陆士伟等(1982)，应用酯酶同工酶测定水稻杂交纯度的研究，《中国农业科学》，(9)：10－15。
〔7〕汪德耀主编(1981)，细胞生物学实验指导，人民出版社，第377－385页。
〔8〕张龙翔等主编(1981)，生化实验方法和技术，人民教育出版社，第99－111页。
〔9〕上海植物生理学会编(1985)，植物生理学实验手册，上海科技出版社，第470－490页。
〔10〕美M．J．Siciliano等编(1980)，凝胶上酶的分离和显现，《植物生理学通讯》，第4期，第59－68页。
〔11〕南京大学生物系编(1979)，生物化学实验，人民教育出版社，第64－71页。
〔12〕胡能书、万贤国编(1985)，同工酶技术及其应用，湖南科学出版社。
〔13〕陆士伟、赖天斌编着(1987)，同工酶在农业上的应用，广东科技出版社。
〔14〕华家圣等(1979)，实用蛋白质化学技术，上海科技出版社。
〔15〕孙敬三等(1987)，植物细胞学研究方法，科学出版社。
〔16〕C．C．赖德等(1987)，同工酶，科学出版社。
〔17〕H．Stegemann et al(1985)，Gel Electrophoresis and Isoelectric Focusing，Institnt fur Biochemie，West Germany．
〔18〕S．R．Draper(1987)，Standard Reference for the Identification of Cultivars of wheat and Barley by Polyacrylamide Gel ElectrophOresis．Seed Sci．& Technol．15：431—434．
〔19〕A．C．DEDALE，el al(1982)，A Revised glasscation of wheat gliadin electropherograms，J．natn．Inst．agric．Bot．16：53—60．
〔20〕A．Clydesdale el al(1982)，A Standard method for the identification of wheat varieties by electrophorosis of their gliadins，J．natn．Inst．agric．Bot．16：16—66．
〔21〕Hans Doll et al(1981)，Preparation of Barley stora geprotein，Hordein，for AnalyticaI Sodium Dodecyl Sulfate—polyacry]amide gel electrophOresis．Analyrical Biochem ical，115：61—66．
〔22〕S．R．Draper et al(1984)，Biochemical Tests for Cultivar IdentificatiOil ISTA．
〔23〕B．J．Cardy et al(1984)，Identification of Soybeon Cultivars using isoenzyme electrophoresis，Seed Sci．& Technol．12：943—954．
〔24〕Arnoldl，Larsen(1966)，A distinction bet ween proteins of annual and perennial ryegrass seeds，Proc．Association official Seed Analysis．56：47—51．
〔25〕D．Blogg et al(1982)，Starch gel electrophoresis for Soybean Cullivar identification，Seed Sci．& Technol，10：19—24．
〔26〕H．J．Andersen(1982)，Isoenzyme character of 47 barley Cultivars and their application in Cultivar identification，Seed Sci．& Technol，10：405—415．
〔27〕T．J．Gilland(1982)，Evaluation of phosphogluccisenrase allaenzyme electrOphoresis for the identification and registration of Cultivars of Perenn i al ryegrass．Seed Sci．& Technol．10：415—430．
〔28〕M．B．German et al(1977)，Variety—Specific electro phoresis Variants of four Soybean enzyme．Crop Sei．，7：963—965．
〔29〕A．L．Iarson(1967)，Elcctrophoretic differences in Seed protein among varieties of Soybean，Crop Sci．7：311—313．
〔30〕B．A．Mardyle et al(1980)，Barley caltivars identification by electrophoretic analysis of hordein proteins．
I．Extraction and separation of hordein proteins and exeronmental-effects on the hordein electrophoregam，Can．J．plant Sci．，60：1343—1350．
〔31〕B．A．Marchyle．eL al(1981)，Barley Cnltivars identifi cation by electrophoretic analysis of hordein prote．ins．Calalogus of electrophoregam for mulae barley Cultivars，Can．Plant Sci．，61：859—870．
〔32〕C．A．Wilkinson，et al(1985)，Polyacrylamide gel electrophoresis for Cultivat identification in tobaco，Crop Sci．，25：971—974．
〔33〕J．F．Wikson et al(1972)，Electrophoretic identification of Agestis palustris and pea pransis CulLivars，Crop Sci．，12：833—834．
〔34〕C．W．Wrigley(1983)，Identification of Cereal varieties by gel electrophQresis of the grain Proteins．Advances in ScienOe and Technology．
〔35〕S．E．Gwrdiner(1986)，SDS polyacrylamide gel electrophoresis of grass Seed prote ins：A method for Cnltivar identification of pasture grass，ISTA 21 Congress，Ⅱ(99)．