染色体操作和外源基因转移
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第328页（7937字）
关于了解基因组关系和遗传控制染色体配对有长足进展。运用非整倍体分析，染色体分带技术，同工酶分析和就地DNA杂交，表明外源遗传物质特性。珍珠粟和水稻原生质体培养和再生植株已成功。建立了渗入完整外源基因组，单个染色体、染色体小片段或极少数外源基因从野生种导入栽培种的技术。选择用于转移外源基因的适宜材料，有赖于基因组关系、种间杂种的染色体配对程度和重组，采用了直接杂交和与栽培亲本回交。有些抗病外源基因曾从野生种转给了小麦、燕麦、玉米和水稻栽培品种。例如草丛抗性基因从Oryza nivara经回交转给了栽培稻。增高生物学产量和籽实产量基因从野生种转给了燕麦、高粱和珍珠粟栽培品种(Frey1983)。当野生和栽培种染色体不配对时，通过常规重组过程转移基因难于成功，可利用某种染色体操作，以取得基因转移。
(一)染色体工程
1．合成双二倍体 双二倍体合成是结合外源和栽培种基因组的重要方法。远缘杂种常有高度不育性。采用不育杂种染色体加倍和产生双二倍体可恢复可育性。45年来，尤其发现秋水仙素后，已取得一些栽培种与有关野生种杂种的双二倍体。除小黑麦外，无一成为新作物的。
这类双二倍体缺乏基因组协调性，减数分裂不稳定和其它不需要状态，这是核-质互作结果。但它们在取得需要衍生体有重要性，如小黑麦。
2．选取多倍体 由于完整外源基因组渗入，可能会带来不需要特性，有些通过双二倍体可能取得稳定多倍体衍生体。小黑麦是选取多倍体的有益经典例证。分别从六倍体小麦-黑麦和四倍体小麦-黑麦杂交曾产生了二类小黑麦：八倍体(2n=8X=56 AABBDDRR)和六倍体(2n=6X=42AABBRR)。八倍体小黑麦由于广泛的减数分裂干扰结果，育性降低和低产，不能用于生产(最近鲍文奎已育成八倍体小黑麦品种——编者注)。另一方面，六倍体小黑麦的减数分裂稳定性和种子产量较高，而仍非理想商品生产品种。Gupta等(1982)已取得显着进展，并育成品种用于生产。从(1)八倍体小黑麦×六倍体小黑麦和(2)六倍体小麦×六倍体小黑麦杂种后代选出的六倍体小黑麦要好得很多。它们的减数分裂稳定性、籽实产量和品质比原来的小黑麦为优越。这种优越性可能由于小麦A与B基因组重组和黑麦基因组一些染色体置换面包小麦D基因组染色体。Gupta(1984)指出29／41小黑麦推广品种有R／D染色体置换。
3．外源添加系 O′mata(1940)描述从供体种的个别染色体添加到受体种的方法。用以克服完整基因组的问题。其法包括二种间杂交，杂种回交或受体种双倍性化，从回交后代选择添加系。取得了具有山羊麦属，冰草属，Haynaldia，黑麦和大麦单加染色体对的小麦。从A．strigosa，A．hirtula和A．barbata单个染色体对添加到栽培燕麦，取得燕麦添加系。从玉米复隐性测交母系杂交产生了玉米-Tripsacum单体添加系。可是，由于外源染色体添加系的外源染色体不稳定性和外源染色体带来的不需要性状的渗入，尚未能成为普遍商品品种。
4．外源置换系 外源染色体置换指栽培亲本的一对或几对染色体为外源种的相等对数所置换。禾谷类置换系研究以小麦为主，其次燕麦、玉米、大麦、水稻，珍珠粟和高粱尚未见报道。为了培育成品种，必需具备：(1)外源染色体必需与受体缺失的染色体相补偿；(2)必需与受体种基因组相整合，而不破坏减数分裂稳定性，可育性，和籽粒产量和质量特性；和(3)对受体种提供某种格外优点。
山羊麦属、黑麦和冰草属外源染色体曾换入小麦。Shepard等(1981)大麦染色体6为小麦6A，6B和6D所置换，育成小麦系，大麦4置换小麦4A育成另一些系。大麦b与小麦b遗传补偿性极好，但大麦4置换的结果不一致。燕麦取得了A．barbata外源染色体的置换系。许多情况下，外源染色体不能完全补偿缺失染色体，有时与需要基因同时带有非需要基因。德国和东欧育成的一些栽培品种是自发置换体，如黑麦1R置换小麦1R，CIMMYT育成若干栽培品种，其中有小麦1B片段为黑麦1R片段所置换，具有广泛适应性和Septoria tritici抗性。
5．诱导部分同源配对 小麦A、B、D基因组间无染色体配对。这种配对为ph(配对部分同源)位点的控制。操作这个位点，能诱导产生部分同源配对和小麦与其它外源种染色体重组。小麦还有其它配对调节者。诱导外源染色体与其小麦部分同源体配对和交换，为外源遗传变异渗入栽培小麦提供独特机会。兹举三种方法如下。
(1)采用野生种以诱导部分同源配对野生种Aegilops speltoides和Avena longiglumis Cw57已知能分别诱导小麦和燕麦部分同源配对，并诱导部分同源重组成功。Riley等(1968)用Aegilops comosa具有格外染色体对(2M)添加系，从Ae．comosa把锈病抗性转移给小麦。这种二体添加系(2n=44)×Ae．speltoides(2n=14)，杂种染色体29，Ae．comosa 2M染色体与小麦2D配对，这是由于ph活性的抑制结果。因为Ae．speltoides的显性等位基因抵消了ph效果。选出了具有Ae．comosa锈病抗性的小麦品系，叫“Compair”。
六倍体燕麦的遗传控制的二倍体配对，也能被二倍体种A．longiglumis(Cw57)所抑制，可与小麦中的Ae．speltoides相比较。前者具有基因(一个或更多)抵消着A．sativa控制抑制部分同源配对的基因作用。曾用A．longiglumis成功地把粉霉病抗性从A．barbata转给燕麦。
A．barbata端着丝点添加系×A．longiglumis与燕麦的八倍体双倍体取得成功。与燕麦回交以取得外源基因转移。衍生系无有端着丝点染色体，提供证据，通过诱导部分同源重组，粉霉病抗性曾从A．barbata转给了燕麦染色体。从A．barbata单体添加系后代，未见那类重组体。Griffith等(1983)用A．longiglumis诱导部分同源配对，和从A．prostrata粉霉病抗性基转给了燕麦。
(2)采用缺体5B系统 染色体5B不存在时，小麦染色体与外源种的染色体间发生配对。缺体5B-四体5D小麦与外源种杂交，由于杂种无5B，外源种染色体与小麦部分同源染色体配对，这些杂种用正倍体小麦品种授粉。Sears(1973)用缺体5B系统，从Agropyron elongatum取得几个带有叶锈病抗性的小麦品种。诱导部分同源配对结果，取得几个小麦-冰草转移体。
5B系统操作也能应用于四倍体小麦。Mello-Sampayo(1972)分离出补偿的单体5B-三体5A植株。用此与黑麦杂交，杂种中观察到高度部分同源配对。Joppa等(1979)建成二体5D-缺体5B置换系，可用于转移外源基因，不用基因ph。
(3)采用ph突变体 Wall等(1971)经乙基甲烷磺酸(EMS)处理后分离出ph突变体。但其部分同源配对水平不如缺体5B。Sears(1979)用X射线辐照正常花粉，分离出另一个ph突变体。
Wang等(1977)用ph突变体与诱导小麦4B和带有线嵌合病毒抗性基因的Agropyron intermedium染色体间重组。Kushnir等(1984)用ph10和ph2以取得部分同源重组和从圆锥小麦把高蛋白基因转给小麦。
Giorgi等(1980)从四倍体小麦品种Cappelli分离出一个突变体，指出Ae．longissima与黑麦部分同源配对增高。1981年取硬粒小麦ph突变体与四个四倍体Aegilops种杂交(Ae．cylindrica，Ae．kotschjii，Ae．columnaris与Ae．triuncialis)。全部杂交染色体配对高，与对照杂种相比的话。
采用ph突变体以外源基因转移与用Ae．speltoides或缺体-5B系统相比，优点是：(1)后代可育性较高；(2)非整倍体量减少；和(3)包括5B于部分同源重组。
(二)基因转移
1．辐照诱导外源染色体片段易位转移小段外源染色体给受体基因组已有所发展。包括辐照花粉或单体添加系种子，在其后代中取得外源染色体易位，或遗传的或细胞学的或二者。Sears(1956)用此法把小伞山羊草带有叶锈抗性小段染色体转给了普通小麦6B。Sharm等(1966)把Ag．elangatum秆锈病抗性转给了普通小麦。Driseoll等(1963)把黑麦锈病抗性转给小麦，其法是辐照双端体添加系。采用这种技术，已育成了若干品系如Transfer，T4，Agatha，和Transec，都具有各种病害抗性。Knott(1961)把带有小麦秆锈抗性的Ag．elongation染色体易位转给小麦6A，是最成功的转移。Ae．elongatum秆锈抗性曾渗入澳洲小麦栽培品种：Eagle，Kite，Jabiru，Avocat。这些品种种植面积占澳洲小麦面积的7%。Riley67软粒红冬小麦具有从小伞山羊草取得的叶锈抗性。
燕麦是另一个六倍体种，用辐照诱导的易位应用于转移外源染色体片段。Aung等(1976)用诱导易位方法，从A．barbata成功地把粉霉病抗性转给栽培燕麦。这种易位包含A．sativa最短染色体的长臂与带有粉霉病抗性基因的A．barbata短臂。原来是从栽培品种manod分离取得的，但现已引入5个其它栽培品种(Thomas，1981)。
2．经单价体错分裂和端着丝点染色体再联合的基因转移 此法包含外源染色体的端着丝点臂与小麦端着丝点组合，继之错分裂成二个单体。Sears(1972)用这种技术取得小麦6B与黑麦5R的易位。即使不存在5B活性，某些外源染色体，如黑麦的，不能与它们的部分同源配对。为此值得试用通过端着丝点结合以引入外源染色体片段。
3．采用远缘杂交组织培养加强变异 组织培养已证明为遗传变异性的新奇源泉。包括禾谷类如水稻、小麦和玉米许多种证实了通过组织培养能使各种简单遗传特性和其它经济性状如株高、分蘖数、穗大小、抽穗期、抗病性，麦醇溶蛋白的电泳模式发生变异。可能是由于染色体结构和数量、隐微染色体易位，转座因素，体细胞基因重排，基因增殖和缺失，体细胞交换和姊妹染色质互换等而产生。
Orton(1980)报道组织培养不育杂种(大麦×芒麦草)其二价体形成比本原杂种(不联会)的增多。取得大麦类型的单倍体。测验的2株(5株中的)出现少数芒麦草同工酶带的单倍体，指出在染色体丢失前，可能发生了某种异种间互换。最近，Lapitan等(1984)报道从小麦×黑麦组织培养再生的双二倍体具有高度染色体结构改变。取10株进行C-带核型分析，指出三个是小麦×黑麦，1个小麦×小麦易位，2个缺失，和5个黑麦异染色质带的增殖。
这似乎是外源基因渐渗入商品栽培品种的有希望技术。对染色体不同配对的远缘杂交特别重要。远缘杂交如小麦-黑麦、小麦-大麦、大麦-黑麦和玉米-Tripsacum将是有用材料，以启动愈伤组织和细胞培养体。采用远缘杂种的外植体(如F1，染色体添加和／或置换系)经组织培养循环，可能增强外源和栽培基因组间遗传互换频率。
4．采用原生质体融合和吸收离体染色体在有性不亲和种间基因转移 体细胞杂交包括原生质体融合可能用于转移有性不亲和种的基因。为产生胞质杂种和细胞器重组体(常规杂交方法不可能产生的)提供独特机会。辐照融合产物可能增高外源和栽培种基因组间遗传材料互换。对转移雄性不育是有希望的。可用栽培品种原生质体与经辐照的细胞质雄性不育系原生质体融合。但由于植株再生困难(除珍珠粟和水稻外)，还只取得极少数再生植株。
Szabados等(1981)提出经另一个种的原生质体吸收离体染色体的技术。从一粒小麦培养的细胞游离中期染色体，采用羟基脲处理取得了培养细胞同步性。结果约有30%小麦细胞集中在中期。用同步细胞培养体取得有丝分裂原生质体用于游离染色体。用聚乙二醇(PEG)处理诱导受体(小麦、芹和玉米)原生质体吸收游离染色体。这是把外源遗传变异转入栽培种的好方法。
5．花粉辐照取得有限的外源基因转移 杂交中采用辐照花粉，取得父本只有部分基因组的转移。Snape等(1983)取与母本有几个标记位点不同的父本小麦花粉辐照，在M2，一致倾向于母本表型，虽未曾得到影响单基因转移。同样，Powell等(1983)发现用辐照花粉进行品种杂交取得的大麦后代，更像母本，但含有若干父本特性。
最近，辐照花粉扩大应用于异种杂交。用带有粉霉病抗性基因的20个Horcleum spontaneum材料的辐照花粉，授粉栽培大麦的12品种或高级世代选系，研究了M2群体(Riggs等，1983)
Pandey(1975)提议用高剂量辐照花粉杂交，以转移某些基因而不是雄核的完全染色体组分。带有钝化染色体的辐照花粉和破碎的染色体片段进入卵核。这种假受精诱导卵进行孤性生殖。在复制期间，雄核DNA渗入雌染色体组分。经加倍染色体产生二倍体性，取得具有选择的父本特性的合子。
这种技术可扩大应用远缘杂交，以超越有性障碍达到基因转移，并可克服杂种无生存力或不育性问题。可能用作体细胞杂交的另一方法，尤其是禾谷类作物。法简而省，可不需要在分子水平上鉴定和克隆基因。但只适用于那些种，经与杀死的辐照花粉授粉后，母本具有孤性生殖产生种子的种。
6．外源DNA微注射和重组DNA技术 用肿瘤浓杆菌(Ti质粒)能把外源基因渗入双子叶培养的细胞。操作T-DNA与插入的选择的显性标记基因相结合，Caplan等(1983)转化烟草植株成功。Murai等(1983)把菜豆基因转入向日葵细胞，也用诱导肿瘤载体。
禾谷类基因转移用的适宜载体尚属不知(已有用OSM载体转移小麦基因成功的——编者)。此外，只有少数禾谷类基因已被克隆。最适用方法是把外源DNA微注射入胚囊和花粉粒(用高产栽培品种为受体)。正在研究把外源DNA注射入共核胚乳或单细胞核或细胞小团块。
除外源DNA微注射外，CIMMYT Mujeeb-kazi等(1984)评价了转化DNA技术。包含着从供体种(Tripsacum)提取DNA，授粉前把玉米花粉浸入DNA缓冲液，尚乏证实外源基因转移的论据。
正在开发重组DNA技术用于禾谷类改良。克隆少数基因已取得有限成功。包括RuBP ease大亚单位基因，玉米和小麦原生质体的一个基因、胚乳蛋白质基因，小麦a-淀粉酶基因。基因克隆虽是重要转化中间步骤，尚未用于禾谷类改良。
通过DNA微注射引入花粉、胚、胚乳和培养的细胞，似乎很有希望，对禾谷类改良有潜力。通过遗传工程把固氮基因渗入禾谷类是最有价值的和热望的设计。可是，有些问题尚待解决。就禾谷类而言，遗传工程技术(基因克隆和适宜基因载体)尚未很好开发。操作固氨系统中至少17个基因似是可贵事业。
兹举例以示染色体操作和外源基因转移如表15-2。
表15-2 禾谷类外源基因转移之例
1=直接杂交；2=桥梁种；3=辐照诱导易位；4=诱导部分同源重组。
【参考文献】：
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