食品中苯并(a)芘的测定

出处：按学科分类—工业技术 中国轻工业出版社《焙烤工业实用手册》第623页（5335字）

1．原理

样品先用有机溶剂提取，或经皂化后提取，再将提取液经液－液分配或色谱柱净化，然后在乙酰化滤纸上分离苯并(a)芘，因苯并(a)芘在紫外光照射下呈蓝色荧光斑点，将分离后有苯并(a)芘的滤纸部分剪下，用溶剂浸出后，用荧光分光光度计测荧光强度与标准比较定量。

2．试剂

(1)苯：重蒸馏。

(2)环己烷(或石油醚，沸程30～60℃)：重蒸馏或经氧化铝柱处理至无荧光。

(3)二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。

(4)无水乙醇：重蒸馏。

(5)乙醇(95%)。

(6)氢氧化钾。

(7)丙酮：重蒸馏。

(8)石油醚(60～90℃)：重蒸。

(9)甲酸(88%～90%)。

(10)无水硫酸钠：120℃烤2h以上。

(11)咖啡因甲酸溶液(150g／L)：称咖啡因(医用或试剂用)15g，溶于适量甲酸中，再稀释至100mL。

(12)甲酸(40%)。

(13)硫酸钠溶液(20g／L)。

(14)脱脂棉：用二氯甲烷回流4h以上。

(15)展开剂∶乙醇(95%)－二氯甲烷(2∶1)。

(16)硅镁型吸附剂：将60～100目筛孔的硅镁吸附剂经水洗4次(每次用水量为吸附剂质量的4倍)于垂融漏斗上抽滤干后，再以等量的甲醇洗(甲醇与吸附剂量克数相等)，抽滤干后，吸附剂铺于干净瓷盘上，在130℃干燥5h后，装瓶贮藏于干燥器内，临用前每100g加5g水减活，混匀并平衡4h以上，最好放置过夜。

(17)层析用氧化铝(中性)：120℃活化4h。

(18)乙酰化滤纸：将中速层析用滤纸裁成30cm×4cm的条状，逐条放入盛有乙酰化混合液(180mL苯、130mL乙酸酐、0．1mL硫酸)的500mL烧杯中，使滤纸充分地接触溶液，保持溶液温度在21℃以上，时时搅拌，反应6h，再放置过夜。取出滤纸条，在通风橱内吹干，再放入无水乙醇中浸泡4h，取出后放在垫有滤纸的干净白瓷盘上，在室温内风干压平备用，一次可处理滤纸15～18条。

(19)苯并(a)芘标准溶液：精密称取10．0mg苯并(a)芘，用苯溶解后移入100mL棕色容量瓶中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于苯并(a)芘100μg。放置冰箱中保存。

(20)苯并(a)芘标准使用液：吸取1．00mL苯并(a)芘标准溶液置于10mL容量瓶中，用苯稀释至刻度，同法依次用苯稀释，最后配成每毫升相当于1．0及0．1μg苯并(a)芘两种标准使用液，放置冰箱中保存。

3．仪器

(1)脂肪提取器。

(2)层析柱：10～15mm，长350mm，上端有内径25mm，长80～100mm内径漏斗，下端具有活塞。

(3)层析缸(筒)。

(4)K－D全玻璃浓缩器。

(5)紫外光灯：带有波长为365nm或254nm的滤光片。

(6)回流皂化装置：锥形瓶磨口处连接冷凝管。

(7)组织捣碎机。

(8)振荡器：装有自制木架，每次可摇6个分液漏斗。

(9)微量注射器：25、50μL。

(10)荧光分光光度计。

4．分析步骤

(1)样品提取：

①粮食或水分少的食品：称取40．0～60．0g粉碎过筛的样品，装入滤纸筒内，用70mL环己烷润湿样品，接收瓶内装6～8g氢氧化钾、100mL乙醇(95%)及60～80mL环己烷，然后将脂肪提取器接好，于90℃水浴上回流提取6～8h，将皂化液趁热倒入500mL分液漏斗中，并将滤纸筒中的环己烷也从支管中倒入分液漏斗，用50mL乙醇(95%)分2次洗接收瓶，将洗液合并于分液漏斗。加入100mL水，振摇提取3min，静置分层(约需20min)，下层液放入第二分液漏斗，再用70mL环己烷振摇提取一次，待分层后弃去下层液，将环己烷层合并于第一分液漏斗中，并用6～8mL环己烷淋洗第二分液漏斗，洗液合并。用水洗涤合并后的环己烷提取液3次，每次100mL，3次水洗液合并于原来的第二分液漏斗中，用环己烷提取2次，每次30mL，振摇0．5min，分层后弃去水层液，收集环己烷液并入第一分液漏斗中，于50～60℃水浴上，减压浓缩至40mL，加适量无水硫酸钠脱水。

②植物油：称取20．0～25．0g的混匀油样，用100mL环己烷分次洗入250mL分液漏斗中，以环己烷饱和过的二甲基甲酰胺提取3次，每次40mL，振摇1min，合并二甲基甲酰胺提取液，用40mL经二甲基甲酰胺饱和过的环己烷提取一次，弃去环己烷液层。二甲基甲酰胺提取液合并于预先装有240mL硫酸钠溶液(20g／L)的500mL分液漏斗中，混匀，静置数分钟后，用环己烷提取2次，每次有100mL，振摇3min，环己烷提取液合并于第一个500mL分液漏斗中。也可用二甲基亚砜代替二甲基甲酰胺。

用40～50℃温水洗涤环己烷提取液2次，每次100mL，振摇0．5min，分层后弃去水层液，收集环己烷层，于50～60℃水浴上减压浓缩至40mL。加适量无水硫酸钠脱水。

甲酸－咖啡因净化提取法(适用于油脂)。称取混匀油样10．00g，用90mL石油醚分数次转入100mL分液漏斗中，用甲酸提取3次，每次10mL，于振荡器上振摇2min，静置分层，弃去下层甲酸。石油醚层以咖啡因－甲酸溶液(150g／L)萃取3次，每次10mL，振摇3min，静置分层，待彻底澄清后，仔细将咖啡因提取液(注意切勿带入醚层或乳化层)转入300mL具塞锥形瓶中，加120mL硫酸钠溶液(20g／L)稀释，加50mL石油醚猛烈振摇重提一次4min，转入250mL分液漏斗中，静置分层，下层再转入原锥形瓶中，加50mL石油醚重提一次，合并2次石油醚提取液，加20mL甲酸(40%)摇1min，弃去甲酸水溶液(除去残留的咖啡因)，将石油醚提取液通过无水硫酸钠(约35g)的漏斗，脱水，转入K－D浓缩器中，减压浓缩至近干，以少量环己烷冲洗导管，混匀，吹氮(或室温挥发)定容至0．2mL，密塞、避光、冷藏保存，备用。

本法无需再过柱净化，以下按4(3)操作。

③糕点类：称取50．00～60．00g磨碎样品，装于滤纸筒内，以下按4(1)①自“用70mL环己烷湿润样品”起依法操作。

在4(1)①至③中，可用石油醚代替环己烷，但需将石油醚提取液蒸发至近干，残渣用25mL环己烷溶解。

(2)净化：于层析柱下端填入少许玻璃棉，先装入5～6cm的氧化铝，轻轻敲管壁使氧化铝层填实、无空隙，顶面平齐，再同样装入5～6cm的硅镁型吸附剂，上面再装入5～6cm无水硫酸钠，用30mL环己烷淋洗装好的层析柱，待环己烷液面流下至无水硫酸钠层时关闭活塞。

将样品环己烷提取液倒入层析柱中，打开活塞，调节流速为每分钟1mL，必要时可用适当方法加压，待环己烷液面下降至无水硫酸钠层时，用30mL苯洗脱，此时应在紫外光灯下观察，以蓝紫色荧光物质完全从氧化铝层洗下为止，如30mL苯不足时，可适当增加苯量。收集苯液于50～60℃水浴上减压浓缩至0．1～0．5mL［可根据样品中苯并(a)芘含量而定，应注意不可蒸干］。

(3)分离：在乙酰化滤纸条上的一端5cm处，用铅笔划一横线为起始线，吸取一定量净化后的浓缩液，点于滤纸条上，用电吹风从纸条背面吹冷风，使溶剂挥散，同时点20μL苯并(a)芘的标准使用液(1μg／mL)，点样时斑点的直径不超过3mm，层析缸(筒)内盛有展开剂，滤纸条下端浸入展开剂约1cm，待溶剂前沿至约20cm时取出阴干。

在365nm或254nm紫外光灯下观察展开后的滤纸条，用铅笔划出标准苯并(a)芘及与其同一位置的样品的蓝紫色斑点，剪下此斑点分别放入小比色管中，各加4mL苯加盖，插入50～60℃水浴中不时振摇，浸泡15min。

(4)测定：将样品及标准斑点的苯浸出液移入荧光分光光度计的石英杯中，以365nm为激发光波长，以365～460nm波长进行荧光扫描，所得荧光光谱与标准苯并(a)芘的荧光光谱比较定性。

与样品分析的同时做试剂空白，包括处理样品所用的全部试剂同样操作，分别读取样品、标准及试剂空白于波长406、406+5、406－5nm处的荧光强度，按基线法由式(1)计算所得的数值，为定量计算的荧光强度。

5．计算

F=F₄₀₆－(F₄₀₁+F₄₁₁)／2 (1)

式中 x₁——样品中苯并(a)芘的含量(μg／kg)；

m₁——苯并(a)芘标准斑点的质量(μg)；

F——标准的斑点浸出液荧光强度(mm)；

F₁——样品斑点浸出液荧光强度(mm)；

F₂——试剂空白浸出液荧光强度(mm)；

V₁——样品浓缩液体积(mL)；

V₂——点样浓缩体积(mL)；

m₂——样品质量(g)。

结果的表述：报告测定结果至小数一位。

6．允许差

相对相差≤20%

7．注意事项

(1)制备乙酰化滤纸时，必须严格控制处理时间与温度。温度高，处理时间长，乙酰化程度过大，则展开时分离困难(R_f值过小)；反之则乙酰化程度太低，则展开时几乎与溶剂前沿相近(R_f过大)。一般以展开后的苯并(a)芘的R_f值在0．1～0．2较为适宜。另外，滤纸规格、乙酰化混合液的数量都要严格控制。

(2)苯并(a)芘具有致癌活性，操作时应戴乳胶手套，接触苯并(a)芘的玻璃器皿需经5%～10%硝酸溶液浸泡后，再进行洗刷。

(3)供测定用的玻璃仪器不能用洗衣粉洗涤，防止洗衣粉中荧光性物质干扰，产生测定误差。