细菌DNA G+C mol%的测定

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《临床厌氧菌检验手册》第98页（2663字）

测定G+C含量的方法很多(表3－2)，热变性温度法操作简单，重复性好，最常使用。

表3－2 测定细菌DNA碱基成分的方法

(一)热变性温度法(Tm)测定G+Cmol%的原理

天然DNA在一定的离子强度和pH中不断加热变性时，随着碱基之间氢键的不断打开，互补双链螺旋(天然构型)不断变成单链，导致核苷酸碱基在260nm紫外线吸收明显增加(增色效应)。当双链完全变成单链后，紫外吸收停止增加。这种由增色效应反映出氢链打开的热变性过程，可以在一个较窄的温度范围内完成。在热变性过程中，紫外吸收增加的中点值所对应的温度为变性温度(Tm)，利用增色效应测定Tm值可反映不同细菌DNA的G+C含量，因为在DNA双链碱基对组成中，A-T碱基对之间形成2个氢键，G-C碱基对之间形成3个氢键，具有3个氢键的G-C碱基对结合较牢，在热变性过程中打开G-C之间3个氢键所需要的温度也较高，所以一个DNA样品的Tm值直接取决于该样品G-C碱基对的绝对含量。G-C含量高的DNA，Tm值也较高，这就是热变性法测定DNA中G+Cmol%的依据。

(二)Tm值测定方法

使用改装的国产710型或Sp700分光光度计。比色杯内样品的温度测定，采用改进的半导体的点温计热敏电阻探针直接测温装置。这个装置可将探针通过比色杯塞子上的孔直径插到比色杯样品液的上部，以不影响光路为准。这样在样品的加热过程中，从点温计表盘上随时可读出某样品的温度。

具体操作为：将待测的DNA样品用1SSC稀释并充分振摇，以除去可能存在的任何微小凝絮，装入比色杯，塞好带热敏电阻探针的塞子，放在比色架内，固定波长260nm，首先记录25℃的吸光度，然后将温度迅速上升到估计变性前3～5℃，停止升温，稳定5分钟，然后一度一度升温，每升1℃停顿5分钟，直到升温后吸光度不再增加为止。每次升温前，准确记录比色杯内温度和相应的吸光度，根据记录的各吸光度的相应温度的相对膨胀体积进行校正，然后用各温度和相对吸光度绘制成热变性曲线，曲线中点对应的温度为Tm值(图3－1)。

图3－1 大肠肝菌K₁₂DNA在ISSC溶液中的热变性曲线

(三)细菌DNAG+Cmol%的计算

G+Cmol%经验公式的提出，都是以直接化学方法测定碱基成分为基础的，为避免不同实验室使用的化学试剂缓冲液、仪器等不同引起的误差，各实验室应建立自己的Tm测定标准和参比菌株。最常使用的参比DNA是大肠杆菌51．2%G+CK₁₂菌株和大肠杆菌E菌株50．9%G+C。在测定未知菌Tm时，要适时地测定大肠杆菌K₁₂Tm，以使校正实验误差。若测定K₁₂Tm值为90．5℃，使用公式(1)、(2)，其他使用公式(3)、(4)。

1．0SSC%G+C=(Tm－69．37)×2．44 (1)

0．1SSC%G+C=(Tm－53．9)×2．44 (2)

1．0SSC%G+C=51．2+2．44(Tm未知菌株－TmK₁₂株) (3)

0．1SSC%G+C=51．2+2．08(Tm未知菌株－TmK₁₂株) (4)

热变性温度法的不足之处是对4个碱基以外的其他稀释碱基不敏感，G+C含量的范围限制在25%～75%，过高或过低都会出现偏差。

(四)DNA中(G+C)mol%在细菌分类鉴定上的应用

(G+C)mol%作为鉴别细菌种属间亲疏关系的一个重要遗传型特征，在细菌分类鉴定中的作用已被人们公认，它有助于对表型(如形态、抗原抗体反应和理化特征)上难以区分的细菌作为分类鉴定，使分类鉴定依据由表现型向遗传型特征深化，并有助于分子水平上探索生物进化的亲缘关系，使人们在寻求物种亲缘关系的征途上向前迈进了一步。

每一个生物物种DNA都有特定的(G+C)mol%，而且生物间的亲缘关系越远，(G+C)含量差别越大；反之亦然。(G+C)含量不同的生物种肯定不是同一种生物种，但不同的生物种(G+C)含量可能是不同的，但也可能是相同的。

细菌(G+C)mol%变成幅度宽(30%～75%)，每一种细菌的(G+C)mol%比较稳定，不受菌龄影响，也不受突变因素之外的生长条件等各种外界因素的影响，所以(G+C)mol%用于细菌分类鉴定极有重要意义。应该指出，单纯依据(G+C)mol%判断，数值不相近的细菌肯定不会是种类相同或相近的种属；但数值相同的细菌未必是相同或相近的种属。因此，在细菌分类鉴定中，一般是将(G+C)%与表型特征配合起来，可弥补单凭表型特征进行分类鉴定的不足。

由于分析方法的误差，(G+C)mol%小于2%的差别是无意义的。若对菌种的不同株进行(G+C)含量的测定，其数值应该是非常相似或相同的，菌株之间(G+C)mol%一般小于4%～5%，这被认为是种定义的主要特征。属内不同种的(G+C)含量虽然有一点不同，但就细菌的全部范围来讲，通常是相当狭窄的，其属内不同种之间的(G+C)mol%很少大于10%～15%，这被认为是属的重要特征；若两株细菌(G+C)mol%差别达20%～30%，说明这两株细菌的分类地位相隔较远，不会是同一属内的种，甚至可能不是同一种内的细菌。厌氧菌主要菌属的碱基组成范围即G+Cmol%，列于表3－3。

表3－3 常见厌氧菌菌属的G+Cmol%