厌氧药敏试验主要方法

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《临床厌氧菌检验手册》第75页（7034字）

(一)琼脂扩散法——KB法

1．菌株接种 挑4～5个菌落接种于胰酶水解酪蛋白植胨肉汤或GAM液体培养基内，37℃厌氧培养48h，或于平板培养基内接种。

2．用于药敏的菌株制备

(1)用于药敏的菌液浓度为1．5～3．0亿／ml。

(2)可用硫酸钡比浊法比浊，决定菌液浓度，硫酸钡比浊管用前振摇10～12次(或用紫外分光光度计测定菌浓度)。

(3)液体培养基用灭菌生理盐水稀释制备浓菌液，固体培养基就直接用灭菌生理盐水制成浓菌液。

3．WC平板或GAM平板培养基接种 将灭菌的棉棒沾菌溶液，于壁上挤除多余的液体，在WC平板培养基上涂布并沿平皿边缘环扫一圈，盖好平皿干燥2～3分钟。

4．抗生素纸片的贴放

(1)从抗生素纸片中相间每24～30mm距离放一纸片。

(2)纸片外缘距平皿外缘约15～20mm。

(3)纸片轻压贴紧。

(4)所有操作必须在10分钟内完成，立即置37℃厌氧培养，48小时后观察结果(生长缓慢的厌氧菌可在96小时后观察结果)。

5．测量抑菌环直径 用双角规和透明尺测量抑菌环(包括纸片直径)直径(D)。

6．判断 参阅表2－3判断

表2－3 常见抑菌浓度和质控参考资料

7．干燥纸片的含药浓度及其制备

(1)选择优抽新华1号滤纸制成直径为6mm的圆纸片。每200张一管，经干烤120℃2小时灭菌，保存备用。

(2)纸片内抗菌药物含量参考表2－3。

8．K-B方法回归曲线的绘制(以氯霉素要求为例) 将被测菌株的MIC转换成log2MIC对数值(双倍稀释法)和相对应的纸片法所得抑菌圈直径一对一对地点在坐标纸上，将数据作统计学上的相关回归分析，得截距a=6．49，斜率b=－0．22，相关系数γ=－0．76。MIC与抑制环直径呈负相关关系，即MIC愈小，抑菌环愈大，P＜0．05，将此数据代入回归方程Y=a+bx，并做出代表此方程的回归线(图2－1)。

图2－1 氯霉素标准曲线(纸片浓度30μg／ml张)

9．细菌对氯霉素的敏感和耐药标准的划分 见表2－4。

表2－4 细菌对氯霉紊的敏感和耐药标准

10．敏感度划分的临床意义

(1)高度敏感：当一种细菌引起的感染用某种药常用量治疗有效，这种细菌就对该药高度敏感，即常规用药时达到的平均血浓度超过对细菌MIC的5倍以上。

(2)中度敏感：当细菌引起的感染仅在应用高剂量抗菌药物时才有效，或者细菌处于体内抗菌浓度浓缩的体液(如尿、胆汁)才被抑制，这种细菌对该药呈中度敏感。常规用药其血液药物浓度一般相当于或略高于细菌的MIC。

(3)耐药：药物对某一种细菌的MIC高于药物在血液或体液中可能达到的浓度。

11．纸片法的质量控制 可用标准菌株，如脆弱类杆菌(B．fragilis ATCC 28285)、多形类杆菌(B．thetaiotaomicron ATCC 29741)、产气荚膜梭菌(C．perfringens ATCC 13124)进行质量控制。

(二)国际厌氧菌药敏标准方法(1986)(限量琼脂稀释法)

目前厌氧菌药敏标准方法据美国临床检查标准委员会(NCCIS)和日本化学疗法(JCAM)方案拟定的限量琼脂稀释法进行的，分为简易判断法和常规琼脂稀释法两大类。

1．抗生素的稀释和原液的制备

(1)抗生素稀释所使用溶剂制备成原液，其浓度、保存条件和期限列于表2－5中。

表2－5 抗菌药物原液的配制和保存期限

(2)抗生素稀释一般采用对倍稀释法，稀释范围确定可由表2－6资料提供参考。

表2－6 抗生素选择稀释浓度参考表常选择稀释浓度(μg／ml)

(3)简易法是做一高浓度和一低浓度2块平板培养基或用纸片，大致可以确定其小抑菌浓度(minimal inhibitory Concentration即MIC)和最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentration即MBC)，见表2－7。

表2－7 简易法常选择的药物浓度

注：药物浓度为ug／ml或u／ml，其他头孢霉素包括噻吩(钠)、唑啉、羟唑等。

2．药物平板的制备

(1)取各种稀释度的抗生素10ml，冷却至50℃左右加于90ml培养基中，混匀后倾注平板，即为含不同药物梯度的平板培养基(百倍稀释)。

(2)抗生素原液为2560μg／ml，对倍稀释法分别为1280，640，320，160，80……，然后分别取2ml加WC固体培养基(＜50℃)倒平板，则平板含量分别为：128、64、32、16、8、4、2、1、0、50、25、0．125、0．0625(μg／ml)，根据表2－5选适当浓度倒平板，即为不同稀释度的药物平板培养基。

3．菌液制备 从GAM平板的48小时培养物上刮菌，以布氏肉汤或BHI汤制备成1．5～3亿／ml(Mcfarland)标准浓度，10倍稀释，最后使用浓度为10⁵～10⁶／ml。

4．接种 用1mm接种环取一满环10⁵～10⁶／ml菌液，或1．5～3．0×10⁸ml菌液取0．001～0．003ml。接种于一种抗生素某种浓度药物平板上，9cm平板培养基可接种4～8株，12cm可接种8～16株，按照划线2cm左右，10分钟处理毕，置厌氧培养37℃，48小时观察结果。

5．结果判断

(1)简易法：按下法判断。

(2)普通法：在平板培养基上不生长的为MIC(如32μg／ml不生长，其以上浓度为64、128…)，再从以上浓度的平板培养基表面刮菌至布氏肉汤或BHI肉汤中，37℃厌氧培养48小时，再转种到WC或GAM平板基上，如64μg／ml平板上仍无菌生长，此浓度为该药品对某菌的MBC。

(三)试管法

试管稀释法是以BHI或布氏汤培养基，加入抗生素标准贮存液后，做不同浓度稀释，然后定量地接种待检菌株液，以确定某药物对待检菌株的MIC和MBC的方法。

1．抗生素标准分剂用量的计算

式中各字母表示：A为应称量标准粉剂毫克数；B为稀释剂的毫升数(即为容量瓶的毫升数)；C为贮存液浓度(一般为1000μg／ml)；D为标准粉的有效力。

例：灭滴灵标准粉的有效力D=1mg=755μg

若用25ml容量瓶(即B)，配制最终浓度为2560μg／ml的贮存液(即C)，应称量标准粉剂为

2．抗生素的稀释 一般以对倍稀释法从第一管到第九管，第十管为空白对照管。例：称量上述灭菌灵84．768mg于25ml容量瓶中，即抗生素贮存液浓度为2560μg／ml，按表第一管取64μg／ml，则各管抗生素浓度为(μg／ml)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

64 32 16 8 4 2 1 0．5 0．25 空白

3．菌液的制备 将培养好的特检菌株和对照已知菌株制备成10⁷～10⁸／ml菌液。

4．接种 在9．9ml的各抗生素浓度试管中加入10⁷～10⁸／ml菌液0．1ml，第一排管接种待检菌，第二排接种对照菌液，最后菌浓度为10⁵～10⁶ml。

所有操作在厌氧环境中进行，或大气中15分钟内接种毕。

5．培养 在37℃，48小时的厌氧培养。

6．培养判断

(1)含抗生素浓度最小而肉眼见无细菌生长的稀释度为MIC。

例如：上述第四管无菌生长(清晰、无颗粒、无沉淀)，则灭滴灵对待检菌株的MIC为8μg／ml。

(2)从肉眼观察无菌管(即MIC)包括以上几个浓度，挑液接种GAM或WC血平板，厌氧培养37℃，48小时后，平板培养基上无菌生长的浓度为某药物对待检菌株的MBC。

例如：上述第四管(8μg／ml)、第三管(16μg／ml)、第二管(32μg／ml)及第一管(64μg／ml)中，用接种环沾菌液接种到GAM血平板上，从第三管以后无菌生长，则灭滴灵对待检菌株的MBC为16μg／ml。

(四)微量法

微量法类同于试管稀释法，只是剂量改变而已，具体方法如下。

(1)用灭菌的96孔或24孔V型孔塑板，每孔先加抗生素液，第一孔根据表2－6选择加入某抗生素浓度，以下将对倍稀释法稀释的呈递减浓度抗生素加入，每孔0．5～0．1ml至第八孔上。

(2)将配好的菌液浓度为10⁵～10⁶CFU／ml也依次加入各孔，每孔加入0．05～0．1ml，从第一孔加至第九孔。

(3)第九孔加入菌液后，再加布氏肉汤或BHI汤0．05～0．1ml，不加抗生素液，第十孔只加抗生素液后，再加布氏内汤或BHI0．05～0．1ml(不加菌液)，此两孔作为对照。所加液体以限制溢出为准。

(4)厌氧培养37℃、48小时，观察孔中无生长者为MIC。

(5)从不生长微孔中取液体接种到GAM血平板上，不生长者为MBC。

(五)联合敏感试验

该试验是为了测定某种药物或某种因素(如培养基成分、pH等)对另一种药物的抗菌效果的影响，即两种药物是否拮抗、协同或无关?或是为了提高药物的抗菌效力。减少用药剂量，避免不良反应，防止或延迟耐药菌株的产生。选择有效的抗菌药物联合使用等一些特殊需要，而进行联合敏感试验，方法有纸片法、纸条交叉法、简化试管法等等。在此介绍两种。

1．纸片法 方法与KB法类似，只是所贴I纸片的距离屡2～3mm，同样必须37℃、48小时的厌氧培养后判断结果。

(1)协同作用：①甲乙两种抑菌区交界角平直；②甲药不敏感，乙药抑菌区向甲药扩大；③无抑菌作用的两药出现了抑菌区。

(2)相加作用：甲、乙两药抑制区交界角钝圆。

(3)无关作用：①细菌对两药都耐受；②细菌对甲药耐受，而对乙药敏感，抑制区交界角尖锐；③细菌对两药都敏感，抑菌区交界角尖锐。

(4)拮抗作用：①细菌对甲药耐受，对乙药敏感，甲药对乙药抑制区呈切割状；②细菌对两药均敏感，乙药使甲药的抑菌偏圆形状。

2．纸条法 在已接种试验菌的平板基表面垂直2条各浸有一种药液的滤纸条，48小时厌氧培养后，根据2种药液抑菌区的加强、减弱或无影响，来判断它们在联合应用时是协同、抵抗或无关。

(1)两者无关(AB两种药物)：

①A敏感，B不敏感，直线相交。

②A敏感，B也敏感，互不影响。

(2)两者拮抗：

①A敏感，B耐药，使A抑菌圈呈弧形。

②A敏感，B也敏感，使两抑菌圈呈弧形。

(3)两者协同：

①A敏感，B虽耐药，但B抑菌圈呈锥形。

②A敏感，B也敏感，形成花瓶形。

3．小数抑菌浓度指数的测定 小数抑菌浓度(fraction inhibitory concentration即FIC)

FIC指数＜1，表示2药有协同。FIC＜0．5时，有明显的协同作用。

4．棋盘格法(Checkboard test)

(1)分别以连续稀释法稀释A、B二药备用。

图2－2 以FIC求AB药的MIC

(2)列三排稀释，第一排为A药系列，第二排为B药系列，第三排含不同浓度的A及B药。

(3)各孔加入10⁵～10⁶／ml菌液0．1～0．5ml，即等量的试验菌液。

(4)求A药的MIC(或MLC，minimal lethal concentration，即最小致死浓度)，B药的MIC(或MLC)和A、B药的MIC，连线作图判断，或求FIC指数来判断联合试验结果。

药物抗菌试验的影响因素包括：①试验菌，最好采用临床新分离菌株，控制菌浓度为10⁵～10⁶／ml，接种量控制在0．1ml以内。②培养基，以WC或GAM培养基为准，pH控制在7．2左右。③抗菌药物，注意完全溶解和精确配制，注意中药中含鞣酸和色泽会影响透明度。