麻风病体液免疫学检查
出处：按学科分类—医药、卫生 科学普及出版社《麻风病实验室工作手册》第172页（8159字）
麻风体液免疫研究的主要方面，是检测血清或其它体液中的ML抗体和抗原，实质上是麻风的血清诊断。检测ML抗体的诊断方法，主要用于麻风病亚临床感染的诊断，了解麻风在某一地区人群中感染的广度，发现高危人群，制定相应的防治措施，并有可能早期发现传染性病人。患者经治后，抗体水平下降，血清检查有助于考核疗效或监测复发。关于体液内ML抗原的检测，现有方法的灵敏度尚不足以作为辅助临床诊断和鉴别诊断的常规工具。但MB患者经有效化疗后，抗原血症消退很快，先于抗体水平和细菌指数的下降，因此抗原检测法能最早地考核化疗对患者的效果。
ML在交叉免疫电泳上显示的抗原组分为其它分枝杆菌所共有，有普遍和广泛的交叉反应。所以，以ML为抗原的抗体阳性，可以是被其它分枝杆菌致敏所产生的抗体，必需用其它分枝杆菌对受检血清预吸收，才有可能显示对ML特异性抗原决定簇的反应。ML和其它分枝杆菌一样富含类脂质，近年来Brennan等发现ML酚糖脂抗原的高度特异性，使麻风血清诊断有了很快的发展。此外，现今有些先进的实验室正从事发展ML的单克隆抗体研究，筛选出了识别ML特异抗原决定簇的细胞株。如果运用多个识别不同抗原决定簇的细胞株，应用免疫竟争或抑制法，就有可能建立特异性和敏感性都较高的血清诊断方法，并有可能用单克隆抗体来纯化特异性抗原组分，阐明其化学结构，进而合成抗原或采用基因工程制备抗原，那时麻风病血清诊断和细胞免疫诊断将比现在大为改观。本节仅介绍现今几种应用较普遍的诊断方法。
一、麻风免疫荧光吸收试验(FLA-ABS)
Abe于70年代初报导了这一方法，实验原理和技术源于梅毒免疫荧光吸收实验(FTA-ABS)。受检血清需先与心脂、卵磷脂、卡介苗(BCG)、牡牛分枝菌共同孵育，吸收掉产生非特异性反应的蛋白和与分枝杆菌呈交叉反应的抗体。但已有实验证实，经某些分枝杆菌致敏的动物，血清虽经吸收，试验仍为阳性。不同地区的环境中常存在多种不同的分枝杆菌，因此要开展这一实验工作，最好能对本地区的环境分枝杆菌有所了解，有选择性地用于吸收受检血清的交叉抗体。本实验的敏感性较高，但特异性差。家属接触者的阳性率可以高达92%，远高于发病率，显然这么高的阳性率仅能提示麻风在家属中感染的普遍存在，而不能提示阳性者是否会发病。由于对荧光阳性及阳性强度的判断是依靠检验者的经验，在紫外线下荧光衰退很快，因此，实验需固定专人负责观察鉴定。在发出报告前不能参阅临床资料，以免接受倾向性暗示。现今，FLA-ABS已有被检测酚糖脂抗体的酶联免疫吸附试验取代之势。
实验方法如下：
1．主要设备 荧光显微境，透射式光源，配备UV，BV和干涉滤片，最大放大倍数400～650倍。其它常用实验室设备包括温箱、超声粉碎机、离心机等。
2．材料
(1)抗原：ML悬液，制备方法见淋转节，本实验要求应用活菌，菌浓度1～1．5×108条／毫升，需有足够数量的单条菌。可分装小瓶，冰冻保存。
(2)BCG和牡牛分枝菌悬液：于Sauton培养基上4周的BCG，以等渗盐水洗3次。1克冻干菌于20毫升PBS液中超声粉碎15分钟，得匀浆液，加叠氮钠(NaN3)至0．1%浓度，4℃储存。牡牛分枝菌([M．vaccae]ATCC15483)于改良Dubos培养基培养1周，采集、洗涤3次，沉淀湿块以9倍量PBS超声粉碎，与BCG处理方法同。
(3)心脂_卵磷脂溶液：0．4%心脂和卵磷脂的无水乙醇溶液，储于紧塞棕色瓶，室温暗处。
(4)荧光抗体：应用抗人IgG荧光抗体，每支冻干制品加0．5毫升蒸馏水溶解加等量BCG悬液，37℃孵育，30分钟。500×G离心，15分，取上清液再离心5500×G，5分钟，取上清用PBS按制品标定滴度稀释，一般为1∶40，再以0．22微米孔经滤膜过滤。制备后应即刻应用。
3．操作步骤
(1)ML涂片：所用玻片应高质量无荧光。用直径为3毫米种菌环取ML悬液在玻片上作4个圆形涂膜，室温干燥。或用吹风机泠风吹干。暂时不用的破片可置盒内，密封，保存于－20℃。开盒前需待储盒恢复至室温。应用时，将涂片浸于四氯化碳液，室温，10分钟。取出待乾，于涂膜上滴0．1%胰酶(Tris－盐酸缓冲液，pH8．0)2～3滴，37℃，1小时。用PBS洗玻片5分钟，3次。干燥后，用指甲漆在4个涂膜间划直线使分隔成4个区域。
(2)受检血清的预处理：取0．4%心脂和0．4%卵磷脂的酒精溶液一份与19份PBS混合(稀释液A)。再制备一份稀释液B，即取A液9份与1份1%牛血清白蛋白、PBS液混合，于小试管内先后放置受检血清0．05毫升、等量的BCG和等量的牡牛分枝菌悬液，再加稀释液A0．35毫升，摇匀，37℃30分钟孵育。离心，500×G，15分钟，再5500×G5分钟，上清液用稀释液B，作4倍系列稀释，即1∶40，1∶160，1∶640等。每批血清标本的实验都必需同时按同法制备阳性参考血清(LL患者混合血清)和阴性参考血清(麻风非流行区健康人混合血清)各一份。
(3)一次反应(抗原抗体反应)：将4个稀释度的血清滴于菌涂膜上，37℃湿盒内1小时。PBS洗5分钟，取出剥去指甲漆，待干。
(4)二次反应：涂膜上滴荧光抗体溶液，湿盒，37℃，1小时或4℃过夜。PBS洗5分钟，待干后，滴0．05M碳酸钠甘油液(pH9．5)，加盖玻片待检。为使荧光在紫外线下消退减缓，可用含1%对苯二氨(p-phenylenediamine，)的PBS液10毫升，甘油90毫升混合，用0．5M碳酸钠－碳酸氢钠缓冲液(pH9．0)将混合液的pH校至8．0。
(5)镜检：采用BV加干涉滤光片。荧光分5级，4+：几乎所有菌(指荧光抗体所显示的单条菌)呈十分强的荧光；3+：大多数菌成强荧光；2+：许多菌有明确的荧光，有些菌荧光很弱；1+：只有少数菌有明确的荧光；±有些荧光微弱的菌；0：可见细菌，但无特异性的荧光。荧光≥2+，抗体滴度≥1∶40为阳性。不到2+的，或虽然超过2+但血清稀释度≤1∶10都是阴性。血清阳性反应的最大稀释度(10×4a)定为抗体滴度。
二、抗ML酚糖脂抗体的检测
ML菌壁及其周围的被感染的组织损害中，积聚了大量具有高度抗原特异性的类脂质——酚结核菌醇三糖苷(分枝菌苷A，MycosideA)，此脂质有三种结构体，以酚糖脂－1(PGL－1)的含量最高，抗原性最显着。PGL－1的抗原决定簇位于三个糖分子上、尤以终端的3，6－氧－甲基葡萄糖最为重要。现今对其化学结构已完全阐明，已有多种半合成抗原能在实验室内批量生产，用于血清诊断，来源已很充裕。半合成抗原不仅保留了原有的抗原特性，且易溶于水，所以在血清诊断的应用中优于天然的PGL－1。现常用的有NT－O－BSA和NT－P－BSA。NT是指天然三糖分子，通过接合臂O(octyl－S－methoxy)或P(phenyl propionyl)与牛血清白蛋白分子连结，此外还有ND－O－BSA、NDP－BSA、ND－A－BSA等，ND是指PGL－1近终端的2个糖分子。特异性与敏感性略逊于三糖分子抗原。
PGL－1的酶联免疫吸附试验证实，与结核病患者血清无免疫交叉反应，非麻风病流行区的健康人群阳性率约2%，MB患者90%以上，PB约50%；对MB家属接触者的阳性率报告颇不一致，(10～35%)。MB患者经有效化疗，一年内抗体滴度就开始明显下降；发生ENL反应时，短暂下降。因此，血清PGL－1抗体检测是当前特异性好和应用最广的对麻风菌感染的血清诊断方法。能用于免疫流行病学调查发现“高危”人群，监测化疗效果和研究反应期的免疫状态等。PGL－1抗体主要存在于免疫球蛋白的IgM组分中，年久难治或复发病例的该抗体也见于IgG组分中，但多数伴以IgM抗体增高，所以在酶联免疫吸附试验中主要用抗人－IgM的酶结合物。
实验方法如下：
(一)半合成抗原的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)
1．主要设备和材料
(1)ELISA实验用的光度计(检测仪)，配备492毫米光栅。
(2)常用抗原有Fujiwara合成的NT－P－BSA和Charterjee合成的NT－O－BSA，两者效用一致。
(3)聚氯乙烯或聚苯乙烯的96孔反应板。
(4)辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM(抗人IgM－HRP)。
(5)阳性质控血清：自LL患者中筛选一份吸收光值(A492)经重复测试都在1．0左右的血清，加0．1%NaN3，分装小瓶，冰冻储存。
(6)其它器皿：如50微升和100微升微量移液管、冲洗壶、吸引器等。
2．缓冲液
(1)碳酸盐缓冲液：Na2CO30．398克，NaHCO30．733克，水250毫升，pH9．6。配制缓冲液的蒸溜水的水质要求很高，需用石英蒸溜的双蒸水，在冰箱内储存期勿超过一周。如不纯净或遭热原污染将导致“高背景的假阳性反应”。
(2)磷酸盐－－吐温缓冲液(PBST)：Na2HPO412．8克，NaH2PO42．62克，NaC10．58克，水1000毫升pH7．4，再加吐温(Tween)20或801毫升。
(3)枸橼酸盐缓冲液：枸橼酸4．67克，Na2HPO47．3克，水1000毫升，pH5．0。高压灭菌，4℃储存。
3．操作步骤
(1)抗原包被：NT－P－BSA或NT－O－BSA用碳酸盐缓冲液按每毫克于5000－10000毫升稀释比例作为包被浓度。或按碳水化合物含量20纳克／毫升。首次配制时可先配制1000倍浓的储存液，冰冻储存，可冻融多次不影响效价，工作液可加0．1%NaN34℃保存。于多孔板的奇排用抗原液包被，偶排仅用缓冲液。每孔50毫升(=1纳克糖抗原)，置湿盒，37℃过液。次晨倾去包被液，PBST冲三次，二次倾倒，最后一次冲洗后吸除残液。
(2)每孔加1%牛血清白蛋白／PBST100微升，同上述条件孵育1小时。此封闭液可以用10%脱脂牛乳，或10%羊血清／PBST替代。倾倒后加受检血清。
(3)受检血清用10%羊血清／PBST按1∶300稀释，每孔50微升。每份标本作三个抗原孔和三个对照孔。孵育1小时，PBST洗4次，其中二次吸尽残液。
(4)羊抗人IgM－HRP的应用浓度由方阵滴定法确定，用10%羊血清／PBST稀释，选择进入曲线平顶峰期前的最大稀释度，一般为1∶2000或1∶4000。每孔50微升，孵育45分钟或1小时，倾去，PBST洗4次，其中二次吸尽残液。
(5)显色：常用底物为邻苯二胺(OPD，O－phenylenediamine)20毫克，溶于50毫升枸橼酸缓冲液，加20微升30%的过氧化氢溶液，需在临用前配制。每孔50微升，置室温暗处，15～20分钟。
(6)加2．5N硫酸50微升终止反应。测A492值。
(7)计算：从三个重复孔中去除一个数值差异最大的孔，计算其它二孔的均值，将抗原孔值减去对照孔值为净值。再计算矫正系数(C．F．)C．F．=1．0／阳性质控血清的净值。每份血清标本的净值×C．F．即为该血清PGL－1抗体的A492值。
(二)PGL1－ELISA
PGL－1为非极性分子不溶于水，为使抗原决定簇吸附在固相载体上不致被类脂质包没，直接用PGL－1作抗原的包被方法，需经处理。Cho将PGL－1于PBS中超声乳化，先将PGL－1溶于氯仿或已烷，分装小瓶，≤50℃使溶剂挥发。然后以1毫克PGL－1于5毫升PBS内超声乳化。应用包被浓度为2微克／毫升。Young等将PGL－1脱酰化，即自结核菌醇的二个羟基上脱去2个分枝菌蜡酸，但三糖结构保持完整，50微克脱酰PGL－1加1毫升水剧烈振摇，再于55℃，15分钟，再猛烈振摇，包被浓度为5微克／毫升。ELISA的材料和程序同上述方法。应注意的唯一差别是PGL－1－ELISA全过程中所用PBS不能含有吐温。
附：PGL－1的提取和脱酰PGL－1的制备
取感染组织匀浆后加三倍量氯仿：甲醇(1∶2)，再加氯仿一倍量研匀，经滤纸于玻芯漏斗上轻轻抽滤。滤液静置，分层后留下层氯仿液，残渣与滤纸用少量氯仿再研磨过滤，合并氯仿液，加入约1／4氯仿量的蒸馏水，洗氯仿液一次。收取氯仿液层，低温使干，即得组织脂质及PGL－1混合提取物。然后经硅酸：硅藻土(2∶1)柱层析，将样品溶于氯仿中，层析柱先经甲醇再2个床量氯仿洗柱，上样后，先以2个床量氯仿洗脱，再洗以2%甲醇／氯仿液2个床量，PGL－1即在这一洗脱中，烘干。粗制PGL－1可再经硅胶－G制备性层析板提纯，可用氯仿：甲醇(15∶1)作展开液。
取提纯的PGL－110毫克，加2毫升10%氢氧化钠的甲醇：苯(2∶1)溶液，充纯氮，旋紧管塞，100℃，16个小时。冷却后逐渐加HC1使pH达4。以三倍量氯仿将脂质抽提，再如上述作制备层析。脱酰PGL－1在层析板上的位置显然滞后于天然PGL－1。称重定量，或采用酚－硫酸法作糖定量(样品水溶液0．2毫升，石碳酸1毫升，快速加入硫酸2毫升，混合。冷却后于490微米读光吸收值。标准曲线用鼠李糖标定)。脱酰PGL－1的三糖分子量约占PGL－1分子量一半。
三、凝集试验
建立一种快速简便的被动凝集试验，是使检测PGL－1抗体的免疫诊断技术，能被广泛地实用于现场的方法。凝集试验的载体颗粒可以是人O型红细胞、绵羊血球、苯乙烯胶乳或明胶等。抗原都用半合成抗原，以物理吸附或化学交联法致敏颗粒。Flurebio生产的试剂盒是以NT－P－BSA致敏的明胶颗粒直径3微米。这一实验的环境温度应不低于26℃，宜用V形底孔径5毫米的血凝板，其它操作程序按试剂盒说明书。凝集试验的结果与ELISA的符合率很高。
四、PGL－1抗原检测
MB患者的血和尿液中可以测到PGL－1和ML的阿拉伯糖半乳糖(arabinogalactose)、阿拉伯糖甘露糖(arabinomannose)等抗原成份。经有效化疗2～4个月内，体液内抗原即迅速下降至阴性。抗原检测可以作为考核化疗效果的最敏感的指标。介绍Cho的两种PGL－1检测方法如下。
(一)抑制ELISA法
1．设备与材料 同检测抗体的ELISA法，此外需有一份多克隆免抗ML－PGL－1抗体，或单克隆抗PGL－1抗体，作为第一抗体。按间接ELISA法用PGL－12微克／毫升包被，将第一抗体作2倍系列稀释，标出A492值的曲线．以进入平顶峰期前的稀释度为应用浓度。
2．血清中PGL－1的提取 受检血清1毫升，冻干，加氯仿：甲醇(2∶1)5毫升，50℃，18小时，吸出抽提液，再以少量氯仿：甲醇液抽提残渣。合并2次抽提液，过滤。加水1毫升，分层后，取有机溶剂相烘干。于硅酸：硅藻土柱提纯(见PGL－1的提取节)，烘干后加PBS1毫升，超声乳化。
3．抑制ELISA标准曲线 于正常人血清中加PGL－110微克，经上述方法提取得超声乳化液，作2倍系列稀释到1∶64浓度，与应用浓度的第一抗体作1∶10稀释，37℃孵育1小时。按间接ELISA法，标出A492值曲线，确定PG1的50%抑制浓度。
4．样品检测 受检血清1毫升，按上述方法提取PGL－1和作抑制ELISA实验。
5．计算 确定样品血清中PGL－1达到＞50%和＜50%的二个稀释度，按公式：2〔(log2稀释度＞50%)+(%＞50%－50%)／(%＞50%－%＜50%)=稀释因子。PGL－1微克／毫升浓度=标准PGL－1的50%抑制浓度×稀释因子×10。抑制小于＜15定为阴性。
(二)点式ELISA法(Dot-ELISA)
此法较简便，灵敏度高，PGL－1250纳克／毫升血清浓度，即能检出，能作定性和半定量法测定。
操作方法：按上述方法制备的PGL－1／PBS乳化液2微升滴于硝化纤维薄膜上，干后，蒸馏水浸湿即浸泡于3%牛血清白蛋白／PBS液中封闭，37℃，1小时。取出，置于以20%羊血清PBS液稀释的抗PGL－1血清，37℃3小时。取出，PBS洗4次共20分钟，再3%牛血清白蛋白／PBS封闭半小时，然后置于20%羊血清PBS液稀释的羊抗第一抗体——辣根过氧化物酶结合物37℃，1小时。同上法洗4次后，静置于底物溶液中，室温，30分钟。底物可采用5－－氨基水杨酸20毫克，PBS－EDTA缓冲液20毫升(Na2HPO40．391克，NaH2PO40．345克，EDTANa20．019克，蒸馏水530毫升，pH6．8)加30%过氧化氢10微升。每批实验同时用PGL－10．1微克到10微克／毫升不等稀释度的标准液作点式ELISA，与自样品中抽提的PGL－1作比较，可得半定量测定。