双缩脲法测定蛋白质含量

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第110页（973字）

双缩脲反应是指双缩脲在碱性溶液中能与Cu++络合生成紫红色物质。双缩脲可由脲缩合而成。

蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与Cu⁺⁺形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。双缩脲法是测定蛋白质浓度常用方法之一，它具有操作简便、快速的特点。其最大的优点是受蛋白质的特异性影响较小，因此不同蛋白质的双缩脲反应基本相似，不受蛋白质种类的影响。缺点是灵敏度较低，所需样品量大。

试剂

(1)双缩脲试剂：称CuSO₄·5H₂O1．5克，酒石酸钾钠6克，溶于500毫升水中，添加10%NaoH300毫升及1克碘化钾。混匀后加水稀释至1000毫升。本试剂可长期保存。

(2)蛋白质标准溶液：用牛血清清蛋白或酪蛋白均可。用0．05N氢氧化钠配制成5毫克／毫升的蛋白液。

操作方法

1．标准曲线的制作：取一组6支试管，分别加入0，0．4，0．8，1．2，1．6，2．0毫升的标准蛋白溶液，用蒸馏水补足到2毫升(各管相当于含蛋白质0，1，2，3，4、5毫克／毫升)。然后加入4毫升双缩脲试剂在室温下(15～25℃)放置30分钟，在721型分光光度计比色测定。以第一管为空白对照波长为540毫微米，读取O．D₅₄₀值。最后以光密度(O．D₅₄₀)为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。

2．未知样品测定：允许测定范围为0．5～5毫克／毫升。

取2毫升样品液，加入4毫升双缩脲试剂，操作同前，比色后从标准曲线上查出蛋白质浓度。再按照稀释倍数，求出蛋白质含量。

〔注〕样品溶液与试剂混和后，有时约30分钟后有雾状沉淀产生。此现象对含脂肪类物质的蛋白质抽提液较易发生，而对于纯蛋白质不明显，如发生沉淀可加入1．5毫升乙醇或石油醚，离心后比色。