蛋氨酸的测定

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第126页（3247字）

方法一：B-S法测定蛋氨酸含量

Barker和Summerson提出了在浓硫酸中，蛋氨酸抑制乳酸的特效反应进行测定，此法不受其他氨基酸干扰，专一性强，快速简便，灵敏、准确。

该法的原理为：当蛋氨酸加入到一定量的乳酸中，在浓硫酸和羟基－联苯(PHD)存在下，蛋氨酸抑制乳酸与PHD的颜色反应，随蛋氨酸量增加，有色化合物吸收值成比例下降。在乳酸量为20微克，蛋氨酸在5～45微克范围内符合比尔定律，可在650nm下进行比色测定。

试剂

(1)4%硫酸铜水溶液：称4克硫酸铜，定容至100毫升；

(2)1．5%P－羟基－联苯的0．2NKOH溶液。

(3)0．1毫克／毫升乳酸水溶液。

(4)DL－蛋氨酸标准溶液(0．1毫克／毫升)，以0．1M盐酸配制。

(5)硫酸(分析纯)。

操作步骤

1．标准曲线的绘制：取蛋氨酸标准溶液0，0．05，0．15，0．20，0．25，0．35，0．45毫升放入试管中，除0管外，均加0．2毫升乳酸(20微克)溶液，加蒸馏水稀释至1毫升，均加入0．05毫升4%硫酸铜，6毫升浓硫酸后，混合物置沸水浴中加热5分钟，然后冷却至室温，再加入0．1毫升PHD试剂。混匀溶液，于30℃温度下保温30分钟(间歇摇动一次)。如果PHD不能完全溶解，需在沸水浴中再加热1．5分钟。以试剂空白为对照，于560nm下测定其光密度。以光密度为纵坐标、蛋氨酸含量(微克)为横坐标绘制标准曲线。

2．样品中蛋氨酸的测定：称脱脂谷物样品100毫克，加6N盐酸溶液2毫升，在105℃水解24小时(以上步骤需在封闭的安瓿中或带塞的试管中进行)。加水稀释，用50毫克活性炭脱色，过滤，以1N盐酸溶液洗涤炭粉，先用5毫升热的，然后用2毫升冷的，滤液与洗液合并，用氢氧化钠溶液调pH至3左右，加0．1M盐酸溶液稀释成50毫升。取0．8毫升样品液。加入0．2毫升乳酸(20微克)液，0．05毫升4%硫酸铜溶液及6毫升浓硫酸，在自来水中冷却。混合物置沸水浴中加热5分钟，然后冷却至室温，再加0．1毫升PHD试剂，混匀，于30℃下保温30分钟(间歇摇动一次)。若PHD不能完全溶解，需在沸水浴中再加热1．5分钟，以试剂空白为对照(不加乳酸)，于560nm下同上进行比色测定。

3．计算：由样品测定的光密度值查蛋氨酸标准曲线得A微克蛋氨酸。代入下式。

式中：A：样品测定液中蛋氨酸含量(微克)

W：样品称重(毫克)。

〔注〕：①含淀粉多的样品预先采用100倍5%三氯醋酸煮沸。溶解淀粉。

②用盐酸水解蛋白质样品时，蛋氨酸有不同程度的破坏。在水解过程中，加一些保护剂，如巯基乙酸，巯基乙醇，苯酚，草酸等。可提高蛋氨酸回收率。

③硫酸浓度，Cu⁺⁺含量，对显色有影响，溶液中硫酸浓度在28N以下不显色，而且混浊，30N以上才形成紫红色透明溶液。Cu⁺⁺催化乙醛与PHD反应，随其含量增加，显色强度增大。

④显色温度一般在30℃，显色30分钟为适。显色后的溶液在室温下放置，2小时内基本上是稳定的(每10分钟增加光密度值0．004～0．006)。

⑤在乳酸中，吸收值降低的蛋氨酸含量范围为5～45微克。

方法二：比色法测定蛋氨酸含量

蛋氨酸与硝普盐〔Fe(NO)(CN)₆〕反应呈有色化合物。蛋氨酸测定范围为25～200微克。

试剂

(1)14．3N氢氧化钠溶液：溶解57．2克氢氧化钠于蒸馏水中，稀释至100毫升。

(2)盐酸－磷酸混合溶液：9毫升浓盐酸与1毫升85%磷酸混合而成。

(3)1%甘氨酸溶液。

(4)10%硝普盐(一亚硝基五氰络铁酸盐)溶液。

(5)1N盐酸溶液。

(6)20%盐酸溶液。

(7)标准蛋氨酸溶液的制备：称50毫克蛋氨酸，加入0．1N盐酸溶液溶解，并稀释至50毫升。取此液5毫升加0．1N盐酸至50毫升，混匀。即为每毫升含100微克蛋氨酸。

操作步骤

1．标准曲线的制备：取8支带塞试管，分别加入0、0．3、(．6、0．9，1．2，1．5，1．7，1．9毫升蛋氨酸标准液(100微克／毫升)，均以0．1N盐酸稀释至5毫升，按顺序加入下述试剂并混匀：1毫升14．3N氢氧化钠，1毫升1%的甘氨酸溶液及0．3毫升10%的新配制的硝普盐溶液，在30℃～40℃水浴中加热5～10分钟，然后用冰水冷却2分钟，并加入5毫升盐酸－磷酸混合液，摇匀，再于室温水浴中冷却5～10分钟，于波长540nm下比色测定，以光密度值为纵坐标，蛋氨酸含量为横坐标，在直角坐标纸上作标准曲线。

2．样品中蛋氨酸含量的测定：称50毫克谷物样品放入安瓿中，加入2毫升20%盐酸并放入105℃恒温箱中水解24小时。稀释后用50毫克活性炭脱色，过滤，炭粉用1N盐酸洗涤，先用5毫升热的，然后用2毫升冷的1NHCl洗。滤液与洗液合并。并用5N的氢氧化钠溶液调节pH至3．5，然后用0．1N盐酸稀释至100毫升。

吸取样品液5毫升，按顺序加入1毫升14．3N的氢氧化钠，1毫升1%甘氨酸溶液及0．3毫升10%的新配硝普盐(硝普酸钠)溶液。在30℃～40℃水浴中加热5～10分钟，然后用冷水冷却2分钟并加入5毫升盐酸－磷酸混合液，摇匀，再于室温下冷却5～10分钟，在540nm波长下比色测定其光密度。

3．计算：

式中：A：待测样品液中蛋氨酸含量(微克)，由标准曲线中查出；

W：样品重(克)；

100：样品稀释液的总体积(毫升)；

10⁶：换算克为微克；

100：换算为百分含量。