薄层层析法分离鉴定氨基酸

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第138页（2267字）

将蛋白质经水解后得样液，将样液点在微晶纤维素薄板上，在溶剂系统中进行双向上行展层，由于各种氨基酸的R_f值不同，而达到彼此分离的目的。

层析后用茚三酮丙酮溶液喷雾显色，与标准氨基酸的位置比较可鉴定样液中各种氨基酸的种类，从斑点的深浅可大致确定含量。

试剂

(1)展层剂Ⅰ：叔丁醇－甲乙酮－氢氧化铵－水溶液(5∶3∶1∶1，V／V)，新鲜配制。

(2)展层剂Ⅱ：异丙醇－甲酸－水溶液(20∶1∶5，V／V)，新鲜配制。

(3)0．5%茚三酮丙酮溶液：称0．5克分析纯茚三酮溶于100毫升无水丙酮中。

(4)微晶纤维素。

(5)标准氨基酸溶液，浓度为0～2mg／ml。

操作步骤

1．制板：称取15g微晶纤维素，加入30毫升水，4毫升丙酮，调成匀浆，用薄层涂布器涂布于洁净干燥的玻璃板上(玻璃板200×200mm，厚度3mm)，制成厚度为0。5mm左右的薄层。置水平架上晾干后即可使用。

2．样品制备：称取蛋白质样品或饲料样品5mg，放入小试管中，加入0．6毫升5．7N盐酸(恒沸点盐酸)。在火焰上封闭管口后，置110℃烘箱中水解24小时。取出，打开封口，置真空干燥器中减压抽干，以除出酸盐。再加入10%异丙醇溶液(先以稀氨水调节至pH7左右)至总体积为0．5毫升，置冰箱中保存备用。

3．点样：用微量注射器吸取样液5微升(每种氨基酸在10微克以下)，分次点加在距板下边缘约2cm处，边点边用电风扇吹干，使点样直径在2～3mm内。

4．展层：采用双向上行法展开。将已点样的两板的薄层面朝外合在一起，放入层析缸(25×10×25cm)中的玻璃船内，将两块板的上部分开靠在缸壁上。先进行碱向展层，将展开剂Ⅰ从两块板中间加入，薄层侵入溶剂中的深度约0．5cm，(切勿使样点侵入层析液中)，盖好缸盖，进行展开。当溶剂前沿达到距原点约11cm时(时间约1～1．5小时)，即可将薄板取出，冷风吹干，放平，刮去前沿上端的黄色杂质部分。再进行酸向展层，将薄板重新放入另一个层析缸中的船槽内，与碱向体系成垂直方向，加入展层剂Ⅱ，进行展层。展开至距原点11cm时，取出，吹干。

5．显色：每块板喷以7～10毫升0．5%茚三酮丙酮溶液，喷雾时应控制使薄层板恰好湿润而无液滴流下。喷雾后的薄板用风扇吹干。有氨基酸存在的地方逐渐显出蓝紫色斑点，仅脯氨酸为黄色斑点。用铅笔将斑点圈出，并用描图纸复绘或摄影保存。

标准氨基酸按上述步骤进行点样、展层、显色。

为了定量，可制备浓度不同的氨基酸标准，供比较确定样品氨基酸的量。

6．定性鉴定

(1)R_f值：在一定条件下某物质的R_f值是常数。R_f值的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析支持物的质量和层析温度等有关。

R_f值的计量：用尺测量显色斑点的中心与原点(点样中心)之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出比值，即得氨基酸的R_f值。

(2)双向层析R_f值由两个数值组成，即在第一相计量一次(碱系统)和在第二相计量一次(酸系统)，分别与已知氨基酸在碱、酸系统的R_f值对比，即可初步确定它为何种氨基酸。

7．定量测定：

(1)根据样液在薄板上斑点的位置、大小、颜色深浅以及检液相当于样品的量，与标准氨基酸层析图谱进行比较，可确定氨基酸的种类和大约含量。

(2)比色测定：找出样品和标准氨基酸的相应斑点，用刀刮下，用硫酸铜乙醇溶液洗脱，并进行比色。

①氨基酸标准曲线的制作：

刮下标准薄板上的氨基酸斑点，分别装入干燥试管内，加入5毫升0．1%硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)溶液：75%乙醇=2∶38的溶液洗脱，间歇摇荡，洗脱液呈粉红色，待15分钟后用520nm波长进行比色测定。以氨基酸含量(微克)为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。其结果应为直线关系，但不同氨基酸其斜率不同。

②样品薄板上氨基酸斑点刮下，以下步骤同标准曲线处理。进行比色测定，根据光密度值在标准曲线上查出氨基酸含量。并进行计算。可得各种氨基酸的含量。