维生素B2的测定
出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第151页（3482字）
方法一：荧光法测定维生素B2的含量
样品在稀盐酸作用下，除去蛋白质，经高锰酸钾氧化，除去干扰物质，再经硅镁吸附剂的柱层析，可提纯维生素B2，利用荧光分光法测定其含量。
试剂和仪器
(1)0．1N盐酸；
(2)3N氢氧化钠：
(3)醋酸；
(4)3%过氧化氢；
(5)3%高锰酸钾溶液；
(6)洗脱液：丙酮∶醋酸∶水=5∶2∶9；
(7)硅镁吸附剂；
(8)磺硫酸钠(Na2S2O4)；
(9)维生素B2标准溶液：准确称维生素B2100毫克，溶于0．01N盐酸溶液中，稀释至1000，毫升(此液1毫升含0．1毫克VB2)此为贮备液。
工作液的配制：吸取贮备液1毫升，用水稀释至200毫升，每毫升0．5微克。
(10)荧光分光光度计；
(11)手提式高压蒸汽锅；
(12)层析柱。
操作步骤
1．样品的提取；
称适量样品(不超过5g，估计维生素B2含量约为5～10微克)，放入200毫升锥形瓶中，加入50毫升0．1N盐酸，倒置烧杯盖于锥形瓶上，在15磅／英寸2(即121℃)下蒸汽高压处理试样15分钟。冷却试样。用3N氢氧化钠溶液调节pH值为6．0，因维生素B2在碱性溶液中不稳定，所以加碱最好用滴管，边加边摇，以免局部碱性过强。然后立即用1N盐酸调节pH至4．5。此步骤可使杂质沉淀。将提取液转入100毫升容量瓶内，用水稀释至刻度。通过快速滤纸过滤提取液。
2．纯化：
取25毫升试管加入10毫升滤液，1毫升冰醋酸，混匀，再加入3毫升3%高锰酸钾溶液，混合后放置2分钟，以氧化滤液中的杂质。然后再加入2毫升3%过氧化氢(注意过氧化氢不可过量)。如有二氧化锰微粒沉淀，可离心除去。
3．过层析柱处理：
在层析柱下端，塞一小棉花团，加入水，再倒入1克硅镁吸附剂，待全部沉下时，让水流去。要注意层析柱中不可有气泡。然后用移液管准确吸取10毫升氧化过的滤液，用热水洗二次，每次10毫升，弃去洗液。再加入20毫升洗脱液于层析柱中，下面用25毫升刻度试管收集层析液，最后用洗脱液调整至20毫升。
维生素B2的标准溶液，也按照以上方法进行纯化，过层析柱处理。
4．荧光测定
(1)取3支10毫升试管，分别各加入5毫升样品测定溶液。(三支试管的编号为1号、2号、3号)。
(2)1号、2号试管再加入1毫升水。3号试管再加入1毫升维生素B2的标准溶液。混匀。
(3)调节荧光光度计的适宜参数。将测定溶液移入石英池中。在激发波长440nm，发射波长525nm的条件下，依次测定每管的荧光强度。1号或2号样液测定管经荧光测定后，加入20mg磺硫酸钠，混匀，立即测定荧光，在5秒钟内读数，作为空白值。
5．计算：
式中：A：测定液加水的荧光强度；
B：测定液加标准液的荧光强度；
C：测定液加20毫克磺硫酸钠混合的荧光强度；
F：测定液稀释倍数；
V：所加入标准溶液的浓度(微克／毫升)
W：样品重量(克)；
5：测定液为5毫升。
〔注〕维生素B2见光不稳定，操作过程最好在避光条件下进行。
方法二：光黄素法测定维生素B2含量
维生素B2在碱性条件下，经紫外线照射后可转化为光黄素。光黄素的荧光强度，大大超过维生素B2。经酸化，用氯仿提取，可测定其荧光强度。来计算出维生素B2的含量。
试剂和仪器
(1)1N氢氧化钠溶液：称45克氢氧化钠溶于950毫升水中，加入新配制的饱和氢氧化钡溶液至不发生沉淀为止，放置24小时后，过滤备用。
(2)冰醋酸。
(3)4%高锰酸钾溶液。
(4)3%过氧化氢。
(5)氯仿：重蒸后无荧光。
(6)0．1N硫酸。
(7)维生素B2标准溶液：准确称0．10克维生素B2，溶于0．05N醋酸中，用0．05N醋酸定容至1000毫升。贮存于棕色瓶中。此为贮备液(0．1毫克／毫升)
工作液的配制：取1毫升贮备液，稀释至100毫升(1微克／毫升)。
(8)荧光光度计。
(9)紫外灯。
(10)暗箱。
操作步骤
1．样液的制备：称5～10克样品，置100毫升棕色容量瓶中，加入0．1N硫酸80～90毫升。在水浴上加热30分钟，不断摇动，冷却后用0．1N硫酸稀释至刻度。过滤，此为样品液(如果样品液过浓，可适当稀释，使维生素B2约为0．2微克／毫升)。
2．测定：取A、B、C三支带塞试管，3支试管分别加入5．0毫升样品液。向A管中再加入1毫升维生素B2标准溶液(每毫升1微克)。再向B、C两管中各加入1毫升水。然后于三管中均加入1N氢氧化钠3毫升，摇匀。
将A、B二管置于紫外光照射之下，光分解1小时，C管置暗盒中1小时，取出后三管中均加入0．3毫升冰醋酸及10毫升氯仿，剧烈振摇提取1分钟，分层后取氯仿层置荧光计比色皿中，测定荧光强度。激发波长440nm，荧光发射波长为565nm。
3．计算：
式中：A、B、C：分别为三管中测试液荧光强度；
W：样品重量(克)；
T：提取液的稀释倍数。