维生素A的测定
出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第179页（5200字）
方法一：紫外分光光度法测定维生素A含量
紫外分光光度法，不用加显色剂显色，可直接测定维生素A的含量，对低含量的样品测定结果也较准确，且操作简便快速。
试剂
(1)乙醚：不应含有过氧化氢。
(2)石油醚(馏程30℃～60℃)：重蒸。
(3)无水硫酸钠。
(4)洗脱液：乙醚在石油醚中浓度的体积比分别为：4%，8%，12%，16%，20%，24%，30%，35%、40%，45%，50%。
(5)80%氢氧化钾溶液。
(6)维生素A油剂。
(7)无水乙醇：不含醛类，
(8)焦性没食子酸：粉状。
(9)25%～28%氨水。
(10)25%三氯化锑氯仿溶液：称25克三氯化锑，溶于100毫升氯仿中，贮存于棕色瓶中。
(11)中性氧化铝(层析用100～200目)：中性氧化铝在550℃马福炉中活化5．5小时，降温后装瓶，冷却后每100克氧化铝加4毫升水，用力振摇，使无块状物，瓶口密封贮存于干燥器内，16小时后使用。
(12)碱性氧化铝(层析用100～200目)：碱性氧化铝在120℃烘箱中烘4小时后，冷却后称100克，置试剂瓶中，加水4毫升，用力振摇使无块状，密封瓶口，存于干燥器内，16小时后使用。
操作步骤
1．提取：准确称10克样品(约含维生素A2500I·U．)置烧杯中，加入40毫升水搅匀，移入250毫升分液漏斗中，分别加入5毫升氨水，35毫升无水乙醇，混匀，然后用乙醚进行抽提，每次用40毫升乙醚，共抽提3次。收集乙醚层，每次用水100毫升洗涤乙醚层共3次。水层再用30毫升乙醚抽提一次。合并所用乙醚。在索氏脂肪抽提器中蒸发除去乙醚。(或在氮气流下蒸发除去乙醚)。
2．皂化
(1)待瓶内乙醚蒸发除尽后，加入30毫升80%氢氧化钠溶液，40毫升无水乙醇和0·8克焦性没食子酸，在83±1℃的水浴中进行皂化30分钟。
(2)冷却后移入250毫升分液漏斗中，加入60毫升水，用40毫升乙醚共抽提3次，合并乙醚抽提液，用水洗至中性，按上述方法采用索氏脂肪抽提器(或在氮气流下)除去乙醚，待瓶内乙醚蒸发后，用5毫升石油醚溶解瓶中内容物，并移入刻度试管中。
3．层析：层析柱规格：Ф1cm，长30cm，具砂芯玻璃板，具活塞。
(1)向层析柱中依次装入8cm高的中性氧化铝，2cm高的碱性氧化铝及1cm无水硫酸钠，用石油醚浸透，将皂化后的样品溶液(即5毫升石油醚样品溶液(缓慢地移入柱内，以1～2毫升的石油醚洗涤试管后，并入柱内，石油醚流速控制在每分钟35滴左右，当液面下降至接近硫酸钠表面时，加入5毫升石油醚，随后再逐次加入5毫升4%，8%，12%，16%，20%，24%，30%，35%，40%，45%洗脱液，最后用50%洗脱液洗脱。
(2)层析柱上第一个黄色层析层，一般是β－胡萝卜素，此带在12%洗脱液前后洗出，收集于25毫升容量瓶中至流出之洗脱液不呈黄色为止。此液收集后可供测定β－胡萝卜素用。
(3)维生素A一般在50%洗脱液中流出，用5毫升刻度试管收集洗脱液，每管收集1毫升，共收集若干管。
(4)检验：从收集的洗脱液中，吸0．2毫升置小试管中，加入0．3毫升25%三氧化锑溶液，溶液如呈蓝色，表明有维生素A存在。
(5)分别从含有维生素A的各管中准确吸取0．5毫升，置10毫升容量瓶中，以石油醚定容。
4．样品测定：用紫外分光光度计，以石油醚为空白，1cm石英比色皿，波长325nm处测定消光度。
5．计算：
式中：D：消光度；
W：样品的重量(克)；
0·3：每0．3微克维生素相当于
单位)；
1830：石油醚中维生素A的
(λ325nm)。
附：β－胡萝卜素的测定：
(1)将(二)维生素A测定中《3②》的，β－胡萝卜素提取液用石油醚定容至25毫升。
(2)440～456毫微米波长范围内，每隔2毫微米以石油醚作对比，测定其吸收率(1厘米玻璃比色皿)。
(3)计算：
式中：D：吸收率；
W：样品重量(克)；
2500：石油醚中β－胡萝卜素的
〔注〕：6微克β－胡萝卜素=1微克维生素A醇。
方法二：
维生素A比色测定法(三氯化锑比色法)
维生素A在氯仿溶液中与三氯化锑作用，产生蓝色化合物，蓝色的深浅与样品溶液中所含维生素A的量成正比，可进行比色测定，
试剂
(1)正己烷。
(2)氯仿。
(3)20%三氯化锑氯仿溶液。
(4)丙酮－己烷混合洗脱液：①4%丙酮－己烷混合液，②15%丙酮－己烷混合液。
(5)乙醚：不应含有过氧化氢。
(6)无水硫酸钠。
(7)80%氢氧化钠。
(8)无水乙醇：不含醛类。
(9)焦性没食子酸：粉状。
(10)维生素A标准溶液：
标准溶液A(1000I·U·／毫升)：称醋酸维生素A0·1克(1克=1000000I·U·)，用氯仿溶解，移入100毫升容量瓶中，用氯仿定容。
标准溶液B(100I·U·／毫升)：吸取维生素A标准溶液A10毫升，置100毫升容量瓶中，用氯仿定容，临用前配制。
标准溶液C(10I．U·／毫升)：吸取维生素A标准溶液B10毫升，置100毫升容量瓶中，用氯仿定容，临用前配制。
(11)中性氧化铝：其活化方法同紫外分光光度法。
操作步骤
1．样品处理：样品中维生素A的提取与皂化，均与紫外分光光度法相同。只有一点不同：即最后提取液蒸干后残渣部分不用石油醚溶解，而改用5毫升正己烷溶解残渣。备用。
2．层析
(1)层析柱规格：Ф12×300mm，下有砂芯玻璃板，具活塞。
(2)层析柱的制备：填装6cm高的中性氧化铝，上面再盖以0·5cm厚的无水硫酸钠，然后用正己烷浸透，即刻使用。
(3)当正己烷液面下降至接近无水硫酸钠顶部时，加入5毫升样品正己烷抽提液，流速每秒2滴左右。
(4)用4%丙酮－己烷混合液25毫升先将β－胡萝卜素洗出，用紫外灯照射，观察维生素A层析带位置(一般此带位置在氧化铝顶部下2cm处)，弃去洗液。
(5)再用15%丙酮－己烷35毫升洗涤维生素A，直至洗液中不再显荧光为止。将收集的维生素A洗脱液在真空下或氮气流下(60～65℃)蒸干，加1毫升氯仿溶解残渣，备用。
3．标准曲线的绘制：
(1)波长，620nm
(2)用氯仿调整分光光度计的零点。
(3)取1毫升氯仿，加入9毫升三氯化锑溶液，测其消光度，作空白对照(必须在3～6秒内测完)
(4)根据样品中维生素A含量的高低，采用维生素A标准溶液B或C。然后依次吸取维生素A标准溶液(B或C)1．0，2．0，3．0，4．0，5．0毫升，分别置于10毫升容量瓶中，用氯仿定容。
(5)分别吸取上述五种标准溶液1毫升，加入9毫升三氯化锑溶液进行测定。
(6)以消光度为纵坐标，以维生素A含量为横坐标绘制标准曲线。
4．测定
(1)用氯仿调节零点。
(2)用1毫升氯仿加9毫升三氯化锑作空白对照，在620nm处测定其消光度。
(3)取样品抽提液1毫升，加9毫升三氯化锑溶液，测其消光度。
5．计算：
式中：C1：样液测定时从标准曲线查出维生素A量(I．U．)。
C2：空白对照从标准曲线查出维生素A量(I．U．)。
F：样品溶液稀释倍数。
W：样品重量(克)
〔注〕①每国际单位(I．U．)维生素A相当于0．3μg维生素A。
②实验时应避光操作，因维生素A受光破坏。
③加入显色剂后，必须在6秒钟内比色，否则褪色。
④三氯化锑腐蚀很强，不能沾在手上。
⑤三氯化锑与水可生成白色沉淀，所以不能碰到水，用过的器皿须先用稀盐酸浸泡后再清洗。