SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第209页（4755字）
十二烷基硫酸钠(简称SDS)。在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键，疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质－SDS复合物。在一定条件下，SDS与蛋白质的结合比为1．4克SDS∶1克蛋白质。由于蛋白质－SDS复合物所带的负电荷，远远超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。亦即消除了由于各种蛋白质所带净电荷的不同而对电泳迁移率产生的影响。这样蛋白质分子在凝胶上的电泳迁移率的大小就完全取决于分子量。
SDS与蛋白质结合后，同时引起蛋白质构象的改变。蛋白质－SDS复合物呈长椭圆形的棒状结构。棒的短轴是一样的，约为18A与蛋白质的种类无关。棒的长轴是变化的，而长轴的变化正比于蛋白质的分子量。这又消除了由于天然蛋白质形状的不同而对电泳迁移率的影响。
影响带电分子电泳迁移率的内在因素有三点：a．分子带静电荷的多少；b．分子量的大小；c．分子的不同形状。由于SDS与蛋白质结合后，消除了其中的二个因素，因而在一定条件下，其电泳迁移率仅取决于蛋白质分子量的大小。这样就可以通过测定及比较已知和未知分子量的蛋白质分子的迁移率，求出未知蛋白质的分子量(本实验基本采用Weber的方法)。
试剂
(1)标准蛋白质(纯品)：
细胞色素C(马心) 分子量为：12500(生化试剂)
胰凝乳蛋白酶元A(牛胰) 分子量为：25000(生化试剂)
胃蛋白酶(猪胃) 分子量为：35000(生化试剂)
卵清蛋白(鸡卵) 分子量为：43000(生化试剂)
牛血清清蛋白(牛血清) 分子量为：67000(生化试剂)
(2)0．2M，pH7．2磷酸盐缓冲液，吸取280毫升0．2M磷酸二氢钠溶液，加入720毫升0．2M磷酸氢二钠溶液，混匀，在pH计上调至pH7．2。
(3)样品溶解液：0．01M、pH7．2磷酸盐缓冲液，内含%SDS，1%巯基乙醇，10%甘油，0．02%溴酚蓝。用以溶解标准蛋白质及待测蛋白质样品。
样品溶解液的配制方法：
SDS 100毫克 甘油 1毫升
巯基乙醇 0．1毫升 溴酚蓝 2毫克
0．2M，pH7．2磷酸盐缓冲液 0．5毫升。
加蒸馏水至总体积 10毫升。
(4)电极缓冲液：0．1%SDS，0．1M，pH7．2磷酸盐缓冲液：称取1克SDS，加入500毫升试剂(2)(即0．2M，pH7．2磷酸盐缓冲液)，用蒸馏水定容至1000毫升。
(5)染色液：称取0．25克考马斯亮蓝R－250，加入454毫升50%甲醇水溶液和46毫升冰乙酸。
(6)脱色液：75毫升冰乙酸，875毫升蒸馏水与50毫升甲醇混合。
(7)SDS：市售化学纯SDS需重结晶后使用。
SDS的重结晶方法：称50克SDS，加100毫升95%的乙醇，70℃下保温溶解，趁热过滤后，于低温(－20℃)下过夜结晶。然后过滤，用预冷的无水乙醇或乙醚洗结晶2～3次，于真空干燥器内干燥或40℃以下烘箱中烘干，备用。
仪器和器材
(1)圆盘电泳槽；
(2)双通玻璃管(内径0．6厘米，长10厘米)12支
(3)制胶玻管架；
(4)100微升微量进样器；
(5)10毫升注射器1只；
(6)注射针头；
①10厘米长注射针头(5号或6号)
②4厘米长注射针头(7号)；
(7)培养皿(直径14厘米)；
(8)电源中压稳流稳压电泳仪。
操作步骤
1．凝胶贮液：称取丙烯酰胺(Acr)30克，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．8克，溶解后加蒸馏水至100毫升，混匀备用。
2．凝胶缓冲液：称取SDS0．2克，加0．2M，pH7．2磷酸盐缓冲液至100毫升。
3．1%TEMED(N，N，N′N′－四甲基乙二胺)：吸取TEMED1毫升，加蒸馏水至100毫升。
4．10%过硫酸铵：称取过硫酸铵1克，加蒸馏水至10毫升。
5．10%凝胶柱的制备
(1)配胶：将以上配制的贮液按下列配方配制成20ml凝胶液。
凝胶贮液 6．67毫升 蒸馏水 1．07毫升
凝胶缓冲液 10毫升 10%过硫酸铵 0．26毫升(最后加入)
1%TEMED 2毫升
以上各液加入混匀后，为了去除抑制聚合的氧气，最好在10%过硫酸铵液加入之前进行抽气处理。(本实验将此步省略并不影响实验结果)。
(2)装管：取双通玻璃管(用洗液洗涤过的干燥的)12支，垂直插放于制胶玻管架上，玻管底部必须紧紧插入橡胶凹槽内。以保证底端封闭。橡胶凹槽在插管之前应涂一层50%甘油或加一滴浓蔗糖溶液，然后用注射器沿玻璃管内壁注入10%的凝胶，直至离玻璃管上端1厘米处为止，加完胶后立即用带有细针头的注射器沿管壁缓缓向胶面加入蒸馏1cm高，进行水封。水封的目的是使凝胶表面平坦，并有隔离空气中氧的作用。
(3)聚合：凝胶管常温静置40～50分钟，当水封层与凝胶而之间的界线十分明显时，此凝胶已经聚合完全。
6．标准蛋白质样品的处理：称取细胞色素C、胰凝乳蛋白酶元A、胃蛋白酶、卵清蛋白、牛血清清蛋白各0．5mg，分别置于带塞试管内，各加入1毫升“样品溶解液”(见试剂3)在100℃水浴中保温3～5分钟，取出冷至室温。备用。
7．待测蛋白质样品的处理：若待测蛋白质样品是固体，其处理方法与标准蛋白质样品相同。
若待测蛋白质样品是水溶液，则需进行浓缩，再取相当于0．5mg固体样品体积，加入1毫升样品溶解液，在100℃水浴中保温3～5分钟，取出冷至室温。备用。
8．加样
(1)新处理过的样品即可用于电泳。如果在冰箱中保存的时间较长，使用前在100℃水浴中加热1分钟，以除去可能出现的亚稳态聚合物。
(2)将凝胶管水封端向上，垂直插入圆盘电泳槽上槽底部的圆孔中，先将电极液加于下槽，将上槽轻轻放下，并轻轻敲动凝胶管以除去电极液与凝胶界面之间的气泡，也可用弯头吸管轻轻吸去。再用滤纸条吸除凝胶管上端的水封层，特别注意不能损坏凝胶面。
(3)将电极液注入上槽，使凝胶管上端的空隙完全充满电极液，如有气泡可用滴管吸除。
(4)用微量进样器向凝胶管中加样，每管加一种样品，各管分别加样30μl(约含蛋白质10μg左右)加样时，将微量进样器的针头伸入电极液在胶面上方大约数mm处缓缓加入，要注意针头不要触及胶面。
9．电泳：加样完毕，上槽接负极，下槽接正极打开直流电源后，先把电流控制在2～3毫安／管，电泳2～3分钟后将电流调至每管8毫安。保持电流强度不变，当“样品溶解液”中的溴酚蓝指示剂迁移至距凝胶管下口约1厘米处，停止电泳。约需4～5小时。
10．剥胶：电泳后凝胶管取下，用带有细长针头(长10cm)的注射器吸满蒸馏水，插入凝胶与管壁之间，一边轻轻旋转玻璃管，一边推针前进，使凝胶柱与管壁脱离，然后用洗耳球对玻璃管一端轻轻加压，凝胶柱脱离玻璃管而滑出。
11．染色：将凝胶柱在染料区带的中心插入细铜丝作为标志、并编号。
按编号放入试管，加入染色液，染色4～12小时(通常染色过夜)。
12．脱色：倾出染色液，用蒸馏水漂洗凝胶柱数次后加入脱色液，数小时换一次脱色液，直至背景清晰为止，约需24小时左右。
13．计算分子量
(1)相对迁移率的计算：
用直尺量出样品迁移距离和染料迁移距离按下式计算。
(2)绘制标准曲线：
以各蛋白质样品的相对迁移率为横坐标，以标准蛋白质分子量的对数为纵坐标，作图。得标准曲线(见图3)。
图3 蛋白质分子量的对数对电泳迁移率图
(3)计算待测蛋白质分子量：根据待测样品的相对迁移率，可直接从标准曲线上查出其分子量(参见图4)。
图4 标准蛋白质在SDS凝胶上的示意图
1．电泳方向；
2．染料迁移距离．
3．蛋白质迁移距离。