动物细胞内核酸含量的测定(DNA和RNA的测定)
出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第205页（3036字）
将饲养动物组织细胞破碎，从脂质、蛋白质等物质中将核酸分离出来，再利用DNA和RNA的水解特性不同而使二者分开。
本实验分离核酸的方法采用“STS”法。用紫外吸收法测定RNA和DNA含量。
试剂和仪器
(1)20%三氯醋酸(TCA)：称取分析纯三氯醋酸100g，加蒸馏水至500毫升。
(2)10%三氯醋酸(TCA)：将20%三氯醋酸稀释1倍。
(3)5%高氯酸(PCA)：吸取分析纯70%高氯酸(HClO4)7．1毫升，加蒸馏水92．9毫升。
(4)无水乙醇。
(5)氯仿－甲醇溶液：氯仿∶甲醇=2∶1(v／v)。
(6)乙醚。
(7)0．3N氢氧化钾。
(8)0．1N盐酸。
(9)6N盐酸。
(10)玻璃匀浆器。
(11)冰冻离心机。
(12)751G紫外分光光度计。
(13)离心管等玻璃仪器。
操作步骤
1．组织匀浆和酸溶性杂质的去除，将动物立即处死，取其肝脏，置已冰浴的小烧杯中。剪碎，称取1克碎肝组织，放入玻璃匀浆器中，加入已预冷的蒸馏水5毫升，研磨成浆。再加5毫升预冷的20%TCA溶液，搅匀并转移到离心管内，于℃～4℃、3000转／分，离心20分钟，上清液必须澄清，弃去。沉淀物加10毫升预冷的10%TCA溶液，搅匀，0～4℃，3000转／分，离心20分钟，上清液澄清，弃去。
2．脂质的去除
(1)沉淀物加预冷蒸馏水1毫升，搅成糊状。用滴管缓慢加入10毫升冷的无水乙醇，成均匀悬浊液，0～4℃于3000转／分离心10分钟，弃去上清液。再加入10毫升预冷无水乙醇，成均匀悬浊液，℃～4℃，3000转／分离心10分钟，弃去上清液。
以上操作均在0～4℃进行。以后操作可在室温下进行。
(2)向沉淀物中加10毫升氯仿∶甲醇(2∶1，v／v)溶液，使成均匀悬浊液，3000转／分离心10分钟，弃上层液。此步重复进行一次。
(3)沉淀物中缓慢加入10毫升乙醚，使成均匀悬浊液，3000转／分离心10分钟，弃上层液。此步重复一次。
(4)把具沉淀物的离心管，置于30℃～40℃水浴中，充分除去沉淀物中的乙醚，最后得淡黄色核酸粉末(尚残存部分蛋白质)。
3．RNA的分离：向核酸沉淀物中(淡黄色粉末)加入0．3N氢氧化钾溶液10毫升，将沉淀物搅碎成糊状(必要时要在玻璃匀浆器中，匀浆成糊状)。37℃水浴保温18小时。此时沉淀物中的RNA已水解成核苷酸。碱水解后，加6N盐酸1．65毫升，充分搅拌冷却，于3000转／分离心15分钟，上清液即是已水解成核苷酸的RNA部分。沉淀物中含有DNA和蛋白质。将沉淀再悬浮于0．1N盐酸8．35毫升中，离心分离。合并上述二步所得上清液，并以0．1N盐酸定容至20毫升，此为1克鲜组织中的RNA部分，置冰箱备用。
4．DNA的分离：将提取出RNA的沉淀物，悬浮于20毫升5%高氯酸溶液中，95℃水浴保温15分钟后，于3000转／分离心15分钟，取上清液并定容到20毫升即是1克新鲜组织中已降解的DNA部分。置冰箱备用。
5．紫外吸收法测定RNA和DNA含量
(1)RNA含量的测定，吸取RNA提取液0．5毫升于试管中，加5%高氯酸9．5毫升，混匀。沸水浴中水解15分钟，冷却后以5%高氯酸为空白在751型紫外分光光度计上于260nm波长处，测其O．D260值(即光密度值)。
(2)DNA含量的测定：
吸取DNA提取液1毫升，加5%高氯酸4毫升，以5%高氯酸为空白，在751型紫外分光光度计上于260nm波长处，测其光密度值。
(3)计算
DNA或RNA溶液测得的结果以每毫升10微克核酸O．D260=0．286进行计算，即：
(0．286是通常从STS法得到的核酸部分所选用的消光系数)。
式中：O．D260：测定溶液在260nm处的光密度值；
10：为测定溶液共10毫升；
；为每毫升1微克核酸在260nm处的光密度值：
W：样品重(克)：
1000：换算微克为毫克；
100：换算为百分含量；
20：提取液总体积(毫升)。
式中：O．D260：测定溶液在260nm处的光密度值。
：为每毫升1微克核酸在260nm处的光密度值。
5：测定溶液共5毫升。
1：为测定时用0．5毫升DNA原液。
20：提取液总体积(毫升)。
W：样品重(克)。
1000：换算微克为毫克。
100：换算为百分含量。