分子生物学诊断
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《禽病手册》第104页（13483字）
分子生物学诊断技术又称基因诊断技术或核酸诊断技术，泛指以核酸分子或基因片段为基础的诊断技术。常用于禽病诊断的分子生物学技术主要有核酸杂交和聚合酶链反应(PCR)，核酸电泳技术、酶切分析可以作为禽病分子生物学技术的辅助手段，新近出现的基因芯片技术将在疾病诊断中发挥更大的作用。
分子生物学诊断技术具有特异、快速、敏感等特点，适于动物发病早期和大量样品的检测。DNA杂交技术的灵敏度已经提高到0．05皮克／微升水平，也就是说，只要样品中有1000个DNA拷贝，就可能被检测出来。使用PCR甚至可以检测出一个拷贝的DNA分子。
病原微生物具有与宿主细胞不同的独特的核酸序列和基因结构，检出这些分子的特异序列，则说明了相应病原体的存在。但某些病原体与宿主细胞或与其他病原体之间也存在着同源的核酸序列，因此应用分子杂交或PCR诊断方法，首先需要了解基因片段的核苷酸序列。迄今为止，已经测定了越来越多的病原微生物基因序列，而且已测定了一些重要病原微生物的全基因序列。通过比较分析，可以获得病原体特异的片段。在这一片段上标记放射性同位素或非放射性物质(如地高辛、生物素等)作为探针，即为分子杂交诊断方法；也可根据这一片段的核苷酸序列，设计一对特异引物，应用PCR技术扩增这一片段。
以下介绍核酸电泳技术、核酸分子杂交诊断技术、PCR扩增技术等三种。
一、核酸电泳技术
严格意义上讲，直接使用核酸电泳技术用于禽病的诊断并不多见，但是电泳技术却是分子生物学的最基本技术之一。
利用核酸电泳技术可以直接检测禽类轮状病毒的感染，并同时鉴定轮状病毒基因组的电泳型，是研究轮状病毒分类和流行病学的最常用方法。病料经适当处理，抽提核酸并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测轮状病毒的RNA，是一种敏感而实用的诊断方法。根据轮状病毒的核酸电泳带排列，可将其分为A、B、C、D四组，核酸排列分别为4－2－3－2，4－2－2－3，4－3－2－2，5－2－2－2。
对于病毒含量较低的样品，往往需要进行浓缩、纯化。通常将病料或感染的培养物冻融处理后，经差速离心、蔗糖密度梯度离心制备病毒样品后，从轮状病毒中提取RNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、银染，根据病毒RNA阶段的数目及图式即可做出判断。血清学分析一般检查不出同一型轮状病毒的微小差异，但PAGE法可以检出。
如果粪样中病毒含量高，可用下述简单的核酸提取方法。取粪液0．25毫升，振荡混合，10000转／分离心沉淀5分钟，吸取上层水相，即为核酸样品，立即进行电泳。加样时，取核酸样品20～40微升，加样品稀释液30～60微升，混匀后即将Eppendorf管放入90℃水浴加热2分钟，随后加样至预先制备好的凝胶孔中。电泳电压为300～500伏或用70～100毫安电流量，电泳1小时后用10%乙醇、0．5%乙酸固定15分钟，并以硝酸银染色后观察。
1990年，马洪超等应用聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测禽轮状病毒(AVRV)和非典型禽轮状病毒(aAVRV)的核酸类型。结果表明aAVRV的核酸电泳带排列为5－2－2－2，与D组一致。而AVRV的核酸电泳带排列复杂。由于这些样本的ELISA和IEM皆为阳性，故样本中含有AVRV确定无疑，而其核酸电泳带却与已有报道不同，经多次重复试验，前后结果一致，考虑是否为新的电泳型。
1993年，汪广荫等应用PAGE检测125份雏鸡粪便样品的禽轮状病毒的RNA，有3份样品出现了特定的轮状病毒RNA电泳图谱。其中一组为D组禽副轮状病毒，另一组为C组禽副轮状病毒，首次发现了C组副轮状病毒可以感染雏鸡。
二、核酸分子杂交诊断技术
核酸杂交诊断技术的基本原理是碱基互补的二条单链核酸退火形成双链。这二条单链中，一条是已知序列的病原微生物探针，另一条是待测样品中的病毒核酸。杂交后，通过特定的方法检测，有杂交信号，则说明样品中存在病原核酸，进而证明病原的存在。
待测的病原核酸可以从病料中提取，也可以从纯化的病原微生物中提取。提取后可在膜上与探针杂交(固相杂交)，或直接在试管的杂交液中杂交(液相杂交)，此外，也可直接在组织切片或细胞涂片上对细胞中的病原核酸进行杂交(原位杂交)。
(一)建立杂交体系
核酸杂交是多种环境因素与二条互补核酸链协同作用的结果，有较高的技术要求。了解各种组分及反应条件对杂交的影响是建立杂交体系，获得理想结果的基础。
(1)温度：杂交反应通常在低于解链温度(Tm值)15～25℃的条件下进行。在杂交体系不含变性剂的情况下，DNA之间的杂交反应通常在68℃进行；当含50%变性剂甲酰胺时，则在42℃进行。
(2)pH值：杂交体系的pH在5～9的范围内对复性无明显影响。杂交反应通常在pH6．5～7．5之间进行。
(3)盐离子浓度：通常采用6倍SSC(1倍SSC为0．15摩尔／升NaCl和0．015摩尔／升柠檬酸钠，pH7．0)缓冲液。
(4)变性剂：杂交体系中加入变性剂可降低Tm值，所以杂交可在更低的温度下进行。常用变性剂是甲酰胺。
(5)DNA浓度：浓度愈高，复性速度愈快。所以杂交反应中应加入足够的探针(但探针浓度过高可产生过高的本底)，尽量减少杂交体积，一般每百平方厘米滤膜用2．5毫升杂交液。
(6)探针长度：溶液中DNA复性率与片段长度的平方根成正比。所以用长的探针可获得高的复性率。但原位杂交通常用较短的探针，以减少探针进入细胞并扩散到靶核酸的阻力。
(7)硫酸葡聚糖：在水溶液中，此化合物表面可吸附DNA探针分子，从而浓缩探针，促进二条核酸链间的配对。其10%的浓度可提高杂交速度10～100倍。使用硫酸葡聚糖可能导致背景加深，所以一般在探针浓度过低的情况下才使用。
(8)杂交时间：它受探针的长度与浓度、反应体积等因素的影响，较短的探针、较高的探针浓度和较小的杂交体积，需要较短的杂交时间。一般来说，杂交时间通常在2～16小时。
(9)预杂交：在杂交前进行预杂交，封闭非特异的DNA结合位点，降低非特异杂交，是杂交的前提。常用的封阻试剂有非特异性的DNA(鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA)和大分子化合物(聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、脱脂奶粉等)。
(10)碱基错配：杂交中碱基错配将明显提高杂交本底，从而影响杂交结果的判定。因此杂交可在更为严格的条件下进行，如低于Tm值15℃的温度下杂交。
(11)漂洗：杂交后的漂洗是减少非特异杂交、降低本底的关键步骤。通常用较低盐浓度(0．1倍SSC)的缓冲液在较高温度下(如68℃)漂洗杂交膜。
(二)核酸打点杂交
核酸打点杂交是最常用的一种杂交检测方法。它是将一定量的病原核酸(DNA或RNA)打点在固相支持膜(通常是硝酸纤维素膜或尼龙膜)上，然后与放射性或非放射性标记的(DNA或RNA)探针进行杂交，杂交后通过放射自显影(检测放射性探针)或显色反应(检测非放射性探针)进行杂交，检测杂交信号。阳性杂交信号表明病原核酸的存在，检测出病原核酸就充分说明发生了病原感染。
1．操作步骤
(1)裁剪一张大小适度的硝酸纤维素膜(NC膜)，将膜在去离子水中湿透(不能完全湿透的膜不宜使用)，再置20倍SSC中浸泡30分钟，然后置滤纸上，室温晾干。
(2)取变性的病原核酸(DNA或RNA)1～5微升点样于上述处理的NC膜上，同时点上探针同源核酸(作为阳性对照)和非同源核酸(作为阴性对照)。
(3)室温干燥后，将点样的NC膜置80℃干烤2小时。
(4)点样膜用6倍SSC、0．1%十二烷基肌氨酸钠、0．02%SDS、1%封阻试剂(一种特殊提纯和处理的脱脂牛奶粉，柏林格公司生产)的预杂交液于68℃预杂交4～6小时。每100厘米2膜用至少20毫升预杂交液。
(5)将膜用杂交液(预杂交液中加入20～80纳克／毫升变性的探针)于68℃杂交12～16小时。每100厘米2膜用2．5毫升杂交液。
(6)室温下用2倍SSC，0．1%SDS溶液洗膜2次，在68℃下用0．1倍SSC，0．1%SDS溶液洗膜2次，每次15分钟。
(7)如果进行放射自显影，则在室温下用0．1倍SSC洗膜一次，室温干燥后，进行放射自显影；如果进行化学显色，则进行如下操作(以地高辛显色为例)。
(8)用100毫摩尔／升Tris-HCl，pH7．5，150毫摩尔／升NaCl短暂洗涤膜。
(9)100厘米2的膜在20毫升抗体结合物溶液中室温反应30分钟。
(10)重复(8)的洗涤二次，每次15分钟。
(11)膜在100毫摩尔／升Tris-HCl，pH9．5，100毫摩尔／升NaCl，50毫摩尔／升MgCl2中平衡2分钟后，加入显色液，于黑暗中显色，当阳性对照的点显出颜色时，可用TE洗膜，终止反应。
2．操作说明
(1)从感染禽的组织、血液、分泌物、粪便等样品中提取的核酸经变性后可直接点在NC膜上，检测可能含有的病原核酸。
(2)点样量不超过5微升，如果样品中核酸含量很低，可在上一次点样干燥后在同一点重复点样。也可用多孔抽滤加样器进行点样，其点样量可达200微升以上。
(3)除NC膜以外，也可用尼龙膜载样。
(4)样品或探针是RNA时，所有试剂及用品均应进行无RNase处理，而且操作要严格，杂交后可以不必如此要求。
(三)核酸酶保护分析法
核酸酶保护分析法是近年来发展起来的一种新的RNA检测方法。它基于一种液相杂交方法，即被检测RNA链与均一分子的单链探针(放射性标记)在试管中进行杂交，然后用适当的单链核酸酶(S1核酸酶、RNA酶A和T1)水解掉未杂交的单链核酸，电泳分离后，通过放射自显影检测未被水解(被保护)的双链杂交体。
与Northern分析法相比，核酸酶保护分析法不需要固相支持膜，所以操作简便，杂交质量也不受RNA转移效率和洗膜条件的影响，而且信噪比大大提高，其检测的灵敏度比前者提高10倍以上。此外，还能精确定量被检RNA。核酸酶保护分析法对RNA样品的纯度和完整性要求不高，样品可以用细胞总RNA，即使轻度降解，也不影响检测结果。采用的探针通常是单链的，但必须是完全均一的DNA或RNA分子。单链DNA探针通常采用M13噬菌体系统，掺入同位素标记的一种dNTP来制备，或者采用末端标记来制备。RNA探针一般采用体外转录系统，掺入同位素标记的一种rNTP来制备。
1．RNA酶保护分析法(RNase protection assay，RPA) 本方法所采用的探针是单链RNA，它比DNA／RNA杂交体稳定得多。杂交后加入适量RNA酶A和T1，它们专一性地水解未形成杂交体的单链RNA，而探针与被检RNA杂交后形成的双链RNA则被保护，电泳分离后，通过放射自显影显示杂交信号。此方法甚为敏感，可以检测每个细胞中1～5个RNA拷贝。操作过程如下。
(1)取5微升RNA样品(含量取决于被检RNA的丰度，可0．5～150微克)，置冰浴。
(2)加入25微升杂交液(80%去离子化甲酰胺，0．4摩尔／升NaCl，40毫摩尔／升PIPES，pH6．4，1毫摩尔／升EDTA，pH8．5)稀释的同位素标记RNA探针(约1×105居里／分钟)，混匀并离心。
(3)95℃变性3分钟后立即置42～50℃水浴中杂交过夜(12～16小时)。
(4)加入300微升RNA酶消化液(300毫摩尔／升NaCl，10毫摩尔／升Tris-HCl，pH7．4，5毫摩尔／升EDTA，pH7．5，20微克／毫升RNA酶T1，40微克／毫升RNA酶A)，于37℃温育30分钟。
(5)加入20微升10%SDS，10微升10毫克／毫升蛋白酶K，于37℃温育30分钟。
(6)加2微升10毫克／毫升酵母tRNA。
(7)酚／氯仿抽提，乙醇沉淀，用10微升电泳上样液(80%甲酰胺，10毫摩尔／升EDTA，pH8．0，0．1%二甲苯蓝FF，0．1%溴酚蓝)溶解。
(8)95℃变性3～5分钟，立即冰浴。于适当浓度的8摩尔／升尿素变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离。最后放射自显影，判定结果。
2．S1核酸酶保护分析法 此方法类似于RPA，只是所用的探针是单链DNA(一般不用双链DNA探针)；所用的酶是S1核酸酶，它能降解单链DNA或RNA，而RNA／DNA杂交体则被保护，操作过程如下：
(1)取0．5～150纳克样品RNA，乙醇沉淀后，重溶于30微升杂交液(见RPA)。
(2)每分钟加入1×105个单链DNA探针。
(3)95℃变性3分钟，立即置52℃水浴过夜。
(4)加入300微升冰预冷的S1核酸溶液(0．28摩尔／升NaCl，0．05摩尔／升乙酸钠，pH4．5，4．5毫摩尔／升ZnSO4，1000单位／毫升S1核酸酶)，37℃水浴30分钟。
(5)加入75微升终止液(2．5摩尔／升乙酸胺，50毫摩尔／升EDTA)，2微升10毫克／毫升酵母RNA。
(6)乙醇沉淀，用10微升上述电泳上样液溶解，95℃变性3分钟，立即冰浴。
(7)如上述电泳和放射自显影。
(四)核酸原位杂交
核酸原位杂交就是保持组织与细胞形态的完整性，用核酸探针直接检测细胞内的靶核酸序列。它可以检测和精确定位胞浆内或细胞器上，胞核内或染色体上的各种靶核酸序列。该方法不需要从组织细胞中提取核酸，对细胞中含量极低的靶序列有较高的敏感性。
原位杂交是可以用于病原感染检测的另一方法。它能检测细胞中病原核酸的复制与表达以及病原的传播，并对细胞中的病原核酸进行定位；应用该方法，还能检测持续感染个体中何种组织含有病原。
除了必须对组织细胞进行固定，以保持原来的形态外，原位杂交与普通杂交方法没有大的区别。对组织细胞固定的好坏直接影响杂交的效果，所以用于核酸原位杂交的固定液必须：(1)理化性质稳定；(2)能很好保持细胞形态的完整；(3)对核酸无修饰和降解作用，并维持其在细胞内的定位；(4)不阻碍探针与靶核酸的杂交，不引起杂交本底过高。符合此条件的理想的固定液有10%甲醛、4%多聚甲醛、戊二醛和乙醇／冰乙酸(3∶1)等，其中以4%多聚甲醛最为常用。
单链RNA原位杂交的基本方法如下。
(1)将组织切片附于清洁的无核酸酶污染的载玻片上，或取2～3滴分散的细胞悬液直接滴于载玻片上，室温干燥。
(2)用4%新鲜配制的多聚甲醛(PBS配)室温下固定20分钟，PBS洗2次。
(3)不同浓度(30%，60%，80%，95%，100%)乙醇梯度脱水，切片或涂片置于100%乙醇中，－20℃保存备用。
(4)用1微克／毫升蛋白酶K(溶于0．1摩尔／升Tris-Hci，pH8．0，50毫摩尔／升EDTA)，于37℃消化30分钟，灭菌去离子水洗涤。
(5)根据探针和被检核酸性质，选择适当的预杂交液，在选定温度下预杂交30分钟。
(6)然后加入杂交液10～100微升(含同位素或非同位素标记的DNA、RNA或寡核苷酸探针)，杂交12～16小时。
(7)用适当的缓冲液洗涤。
(8)于切片或涂片上铺以感光乳胶，进行放射自显影，或者用免疫酶法进行显色反应。
(9)显微镜下观察结果。原位杂交检测双链DNA时，第(3)步后用RNA酶去掉细胞中的RNA，降低本底。第(4)步后用乙醇脱水，置70毫摩尔／升NaOH变性3分钟，冲洗，再脱水，最后进行预杂交和杂交。
三、PCR扩增技术
PCR扩增技术是根据被扩增DNA片段的序列，人工合成两端各约5～30碱基的单链DNA引物。取极微量的模板DNA，加入Taq或VentDNA聚合酶，A、C、G、T4种脱氧单核苷酸以及两端的DNA引物，置于PCR扩增仪上即可以进行DNA扩增。一次PCR循环，包括变性－退火－延伸三个过程，通常使用三个可调温度及时间：(1)DNA变性温度(一般为94℃)及时间，在此温度下模板DNA的双链分开。(2)退火温度及时间，这个温度可以根据DNA引物的长度和G+C含量计算出来，一般在42～62℃之间。退火处理后，DNA引物互补结合到变性的DNA模板上。(3)聚合酶延伸反应温度多为72℃，反应时间随被扩增片段的长度而定，一般每1000个碱基需要30～60秒和1单位TaqDNA聚合酶。有时PCR使用双温循环，即92～94℃变性，68℃退火和延伸。
理论上，每循环一次，模板DNA量扩大一倍，所以模板DNA的量是按2n指数幂进行扩增的，n代表PCR循环次数。虽然由于经多次循环与高温处理后，DNA引物消耗，Taq酶活性下降，但PCR还是可在数小时之内对仅有的几个拷贝的基因放大数百万倍，使其在凝胶电泳后形成明显可见的DNA带。另一方面，很高的合成效率使得PCR容易出现非特异性扩增，所以要获得预想的结果，必须选好欲扩增片段在基因组上的位置，设计特异的引物序列，优化PCR反应的各种条件和选定适当的循环参数。
(一)诊断PCR技术的设计
1．扩增片段的确定 为了获得特异的扩增，必须选择病原基因组上具有独特结构的基因区域进行PCR扩增，这一区域在序列组成或长度上，无论与较近亲缘关系还是较远亲缘关系的其他病原应有明显的区别。
2．引物设计 引物是影响PCR扩增效率和特异性的关键因素。作为PCR，选择引物应遵循一些基本原则：(1)引物长度以15～30核苷酸为宜。(2)正义、反义二条引物链间的距离适中，一般使扩增出的片段在300～1000碱基对之间；如果用RTPCR检测RNA病原，引物间距离控制在500碱基对左右最佳。片段过短则影响电泳结果判定，过长则不易扩增。(3)引物碱基组成应随机分布，G+C含量在45%～55%左右为宜。(4)引物自身不形成二级结构，引物间不应有互补序列(4个碱基以上)。(5)引物序列必须是被检病原特异的。(6)原则上引物3′末端碱基与模板DNA一定要配对，此外3′末端碱基最好选T、C或G，而不选A。
3．PCR缓冲液 PCR反应标准缓冲液应含：50毫摩尔／升KCl，10毫摩尔／升Tris-HCl(pH8．3)，1．5毫摩尔／升MgCl2和100微克／毫升明胶或乙酰化牛血清白蛋白(BSA)。其中Mg2+浓度变化明显影响反应的特异性和扩增效率。Mg2+过多则导致非特异扩增产物增加；Mg2+不足则扩增效率降低。为了取得最佳扩增效果，可先行预实验，以确定最佳Mg2+浓度。
4．引物量 PCR反应中所用引物浓度通常在0．1～0．5微摩尔／升之间。浓度过高将出现非特异片段的扩增，过低则不能扩增出足够的特异带，最佳用量可以通过系列浓度实验来确定。
5．dNTP dNTP(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)溶液的pH应调至7．0。在标准PCR反应中，每一种dNTP的使用浓度为50～200微摩尔／升(足够产生7～25微克NA)，更高浓度dNTP将导致错误掺入，从而影响扩增序列的真实性。
6．TaqDNA聚合酶 PCR反应中，该酶的用量通常是2．5单位(100微升反应体系)。加酶量过多将导致非特异性片段的扩增。
7．变性剂 反应中加入适量变性剂(如二甲基亚砜、尿素、甲酰胺等)可减少模板的二级结构，提高反应的特异性。
8．循环参数 变性是循环的第一步，变性不完全，扩增明显受到影响，变性温度太高或时间太长，TaqDNA酶的寿命会受到影响，使得循环次数明显减少。绝大多数PCR变性温度在92～94℃之间，时间通常控制在40秒左右；退火是循环的第二步，退火温度的选择决定着引物与模板互补结合的效率和特异性，是PCR能否成功的关键因素。选择适当的退火温度取决于引物的长度、G+C含量、模板的纯度和丰度。较高的退火温度可提高引物与模板配对的特异性，从而提高反应的特异性。就含量和纯度较高的模板而论，对于G+C含量在50%左右、约20核苷酸长的引物，55℃是常用的退火温度。如果引物较短(12～15核苷酸)，退火温度可降至40～45℃。
对于丰度极低的模板的PCR，特别是稀有RNA模板的反转录PCR(RT-PCR)，在最初的1～5个循环可以用更低的退火温度，然后使用正常的退火温度，这样能明显提高PCR的成功率。无论什么样的退火温度，时间通常控制在50秒左右。循环的最后一步是延伸，由于TaqDNA聚合酶只有在高温下才能发挥最大活性，所以延伸在70～75℃温度下(通常在72℃)进行，但延伸反应的时间随欲扩增片段长度的增加而适当延长。一般来说，每扩增1000碱基对的片段，用1分钟时间是足够的。温度及时间确定以后，PCR循环次数主要取决于模板量。但循环次数通常选定在25～30次，经过这些次数循环后，PCR产物的累积即可达到电泳后肉眼可见程度。除非模板浓度极低，如只含一个拷贝，循环可增加至40次。
目前双温PCR正逐渐被采用，其特点是退火与延伸在一个温度下进行，这一温度通常在68℃左右。双温PCR大大简化了操作程序，缩短了操作时间，同时明显提高了反应的特异性。
(二)PCR反应的一般程序
(1)按以下程序，将各成分依次加入0．5毫升PCR反应管：
10倍标准PCR缓冲液 10微升
4种dNTP混合物，每种浓度为1．25毫摩尔／升 16微升
正向引物 100皮摩尔或0．5微克左右
反向引物 100皮摩尔或0．5微克左右
被检DNA样品 取决于靶序列含量，可达2微克
加灭菌去离子水 至终体积100微升
石蜡油 20微升
(2)92～95℃变性5分钟。
(3)置选定的退火温度，加入2．5单位TaqDNA聚合酶(置退火温度以下，引物与模板可能出现许多非特异杂交，此时加入酶就可能有非特异链的合成，最终导致非特异带扩增)。
(4)置PCR仪或水浴锅，用选定的变性、退火和延伸温度及时间，进行25～40次自动或手动循环反应，最后一个延伸温度保温5～10分钟。
(5)取5～10微升反应液进行琼脂糖凝胶电泳、观察、拍照和记录。
10倍标准PCR缓冲液：
500毫摩尔／升KCl，
100毫摩尔／升Tris-HCl(pH8．3，室温)，
15毫摩尔／升MgCl2，
0．1%明胶或乙酰化BSA
(三)PCR用于DNA病原检测
无论单链或双链病原DNA，均可用PCR进行检测。检测样品可以是纯化DNA，也可以是细胞、组织及任何可能含有病原的样品。一般无需提取DNA，可直接取少量样品(少于10微升)，煮沸变性10分钟后进行PCR测定。引物之间的距离(决定扩增DNA片段的长度)控制在300～1000碱基之间最佳。为了尽量减少PCR的非特异反应，可进行如下调整。
(1)增加DNA引物的长度。一般引物长15～20碱基，但可以增加到25～30碱基。
(2)引物加长后，提高退火温度，增加反应的特异性。
(3)选择其他DNA序列重新合成特异的DNA引物。
(4)如果病原序列来源于cDNA，则应考虑到某些病原DNA上含有内含子，可能使被扩增的片段远远大于原设计，甚至无法得到这样大的片段。
(四)PCR用于RNA病原的检测
首先提取病原RNA，加入反转录酶合成cDNA，然后才能进行PCR扩增，因此必须进行两步反应(反转录酶不耐热)，即反转录PCR(RT-PCR)。
第一步：反转录合成第一链cDNA：
(1)取一反应管，分别加入：
病原RNA(或感染细胞总RNA) 适量
10倍标准PCR缓冲液 5微升
2．5毫摩尔／升dNTP 5微升
正向引物 0．5微克
反向引物 0．5微克
RNasin 40单位
反转录酶(AMV) 10单位
去离子水 至终体积50微升
(2)42℃水浴1小时。
第二步：PCR扩增：
(1)将上述反应物煮沸变性5分钟，立即冰浴。
(2)加Taq DNA聚合酶2单位。
(3)置PCR仪，用选定的变性、退火和延伸温度及时间，进行30～40次循环反应。
(4)取5～10微升反应产物，进行电泳、观察、拍照和记录。
反转录反应中，用PCR缓冲液代替反转缓冲液，同时加入正、反引物，既简化操作步骤，又不影响反应效率。
RT-PCR试剂盒有市售。
通常将病料或感染的培养物冻融处理后，经差速离心、蔗糖密度梯度离心制备病毒样品后，从轮状病毒中提取RNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，银染，根据病毒RNA阶段的数目及图式即可做出判断。血清学分析一般检查不出同一型轮状病毒的微笑差异，但PAGE法可以检出。
如果粪样中病毒含量高，应用下述简单的核酸提取方法，也可获得满意的电泳结果。取粪液0．25毫升，如上振荡混合。10000转／分离心沉淀5分钟，吸取上层水相，即为核酸样品，立即进行电泳。加样时，取核酸样品20～40微升，加样品稀释液30～60微升，混匀后即将Eppendorf管放入90℃水浴加热2分钟，随后滴加凝胶板。电泳电压为300～500伏或用70～100毫安点流量，电泳1小时后用10%乙醇、0．5%乙酸固定15分钟，并以硝酸银染色后观察。