血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验(以鸡新城疫为例)

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《鸡病诊断技术手册》第113页（3413字）

(1)材料

①抗原：鸡新城疫病毒(NDV)或NDV稳定浓缩抗原。

②抗体：抗NDV阳性血清。

③红细胞：0．5%的鸡红细胞悬液。

④稀释液：0．01M pH7．2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)(内含NaCl 0．85%)。

⑤96孔V型血凝板、微量加样器、吸头、微型振荡器等。

(2)操作

【血凝试验】用微量HA试验测定NDV抗原的血凝效价：

①用微量加样器取25μl稀释液加入V型血凝板各孔。

②用微量加样器换一个新的消毒吸头，取25μl NDV抗原液，加入第1孔。然后用微量加样器通过吸入、排出等方式将抗原液与稀释液混匀。从第1孔中取出25μl的NDV抗原液加入第2孔，混匀后再取25μl加入第3孔，依次做系列稀释，稀释度分别为1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64， 1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048等，最后从第11孔取25μlNDV抗原液弃去。第12孔为对照孔。

③换新的吸头用微量加样器取25μl稀释液加入试验系列稀释NDV抗原液的孔中。同时加入对照孔。使每孔中含50μl的液体。

④取25μl0．5%的鸡红细胞悬液加入对照孔(一般用2－4个孔做为对照孔)。然后按照与稀释NDV抗原液相反的方向，将每个抗原液孔中各加入25μl的鸡红细胞悬液。试验孔与对照孔中含75μl的液体。

⑤将血凝板置于微型振荡器上振荡80－90秒钟，使红细胞与NDV抗原充分接触。然后置于37℃湿箱或室温下45分钟左右判定结果。

⑥结果判定：红细胞均匀铺布孔底为完全凝集，即100%凝集，通常以“++++”表示，有时边缘卷曲呈荷叶边状；红细胞铺布孔底呈薄层凝集，但面积小于100%凝集，此种凝集为75%凝集，通常以“+++”表示；红细胞在孔底呈薄层凝集，但面积较小，中心致密，边缘松散，此种凝集为50%凝集，通常以“++”表示；大部分红细胞集中沉集于孔中央，周围有少量的凝集，此种凝集为25%凝集，通常以“+”表示；红细胞沉于孔底中央，呈小圆点状。周围无分散凝集的红细胞，这种现象为0%凝集，即不凝集，通常以“－”表示。

以出现红细胞完全凝集(100%凝集)的病毒抗原液的最大稀释倍数，称为该抗原液的血凝效价或血凝滴度。出现完全凝集最大稀释倍数的抗原液25μl为1个微量血凝单位。在进行血凝抑制试验时，需要用4个微量血凝单位的抗原液。譬如，NDV抗原液的血凝效价为1∶1280，1个微量血凝单位即将原NDV抗原液稀释1280倍后的25μl抗原液。要使25μl抗原液中含有4个微量血凝单位，即将NDV抗原液做1280／4=320倍稀释。

【血凝抑制试验】

①用微量加样器取25μl稀释液加入V型血凝板各孔。第12孔加入50μl稀释液。

②取25μl血清加入第1孔，充分混匀后取出25μl加入第2孔，再混匀后取出25μl加入第3孔，依次进行系列稀释至第11孔，然后取出25μl弃掉。血清稀释度从第1孔至11孔分别为1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048。第12孔留做对照孔。

③取4个单位的NDV抗原液25μl加入第1至11孔，将血凝板置于振荡器上振荡60－90秒钟，然后在室温或37℃条件下静置20分钟。

④每孔加入25μl红细胞悬液，振荡60－90秒钟，置于室温或37℃条件下45分钟左右判定结果。

⑤结果判定：结果判定方法与血凝试验相同。

以红细胞凝集被完全抑制，即不凝集的血清最高稀释倍数，称为该血清的血凝抑制(HI)效价或滴度。

(3)注意事项

①每次试验应设立红细胞对照孔，如果对照孔发生凝集，说明红细胞悬液不合乎标准，试验不成立。

②结果判定时间应以对照孔红细胞完全自然下沉到孔底中央为准，判定结果应及时，以防红细胞凝集后自然脱落，沿孔底倾斜下滑。

③在加NDV抗原液、血清、红细胞时应更换新的吸头。在HA试验中，加红细胞悬液时应先加对照孔，然后再从高稀释度向低稀释度方向加试验孔。在HI试验中，加红细胞悬液时也先加对照孔，但在加试验孔时，应从低血清稀释度向高稀释度方向依次加入红细胞。

④若用HA试验测定病毒抗原的血凝效价，每一个抗原样本应做二排孔，即同一稀释度的抗原有两个孔。在判定结果时二排孔的血凝图象可互相补充，以求得到较准确的结果。

⑤试验完毕后，血凝板应进行酸处理，充分清洗后，过蒸馏水。干燥后备用。

(4)应用 本试验从原则上可以检测任何具有凝集红细胞特性的抗原，以及相应的抗血清。目前在集约化养鸡场中，常用于新城疫(ND)和产蛋下降综合症(EDS－76)的监测。

①ND监测：鸡群免疫后，2－3周采血测定HT效价。血样数根据鸡群的大小而定，1000只以下的鸡，取10－15只鸡的血样，5000只以下时，取25－30只鸡的血样，10000只以下的鸡群，取40－50只鸡血样。测定结果以X=logT(T为HI效价)来表示，然后计算各样本的平均值

确定HI效价的标准不尽相同，应根据具体情况而定：雏鸡和后备鸡的HI效价应为X≥4；蛋鸡为X≥5；种鸡为X≥6。若在免疫后2－3周监测的结果达不到标准，应在1周后重复监测一次，若仍达不到要求，则说明免疫失败，应考虑重新免疫。

监测时间与使用的疫苗有关，用Ⅱ系、Ⅲ系、Ⅳ系和克隆－30疫苗免疫鸡群应每月监测一次。用油苗与Ⅰ系疫苗免疫的鸡应每1－2月监测一次。

②EDS－76监测：具体方法与ND监测相同，推荐HI效价标准X≥5，仅供参考，所用红细胞的浓度为0．8%。

③IB(传染性支气管炎)监测：用HI试验监测鸡群中IBV抗体的标准仍在探索中，而且IBV多血清型也造成IB监测的困难。尽管如此，HI试验仍不失为监测IB的良好方法。

④血清学诊断：如果鸡群在抗体监测中有HI效价参差不齐的现象，有的血清样本HI效价很低，有的很高，甚至达1024－2048以上，同时鸡群伴有一定的产蛋下降或轻微呼吸道症状或少数鸡有神经症状，则提示鸡群发生了非典型新城疫。如果在ND、EDS、IB的监测中，抗体效价达到高峰后，抗体效价每次监测都应呈下降趋势，倘若抗体效价出现突然急剧升高的不规则现象，则提示鸡群可能发生了野毒感染，应及时采取措施。