单层细胞的培养

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第558页（3859字）

一、一般步骤

(一)细胞的分散 动物组织中的细胞通过粘蛋白和胶原等物质结合在一起，因此要用各种蛋白水解酶消化，才能使完整的单个细胞解放出来。用于这项目的的酶有(1)胰蛋白酶(0．25%)。(2)链霉蛋白酶(0．25%)——此酶用于原代细胞效果优于胰蛋白酶，因为它消化快得多而且不会形成细胞团，但用于传代细胞系则差。另外与胰蛋白酶不同之处是血清等蛋白质不能抑制其活性。(3)胶原酶(0．25%)——此酶对细胞的损伤最小，一般用于纯化细胞的培养。商品制剂非纯品，通常含有其他的酶，包括蛋白酶、脂酶和多糖酶，但可用。应用最多的首推胰蛋白酶，有时它和EDTA(0．02%)等量混合效果更好。组织块用胰蛋白酶消化有2种方法。

1．热消化

(1)用无菌操作采集组织，放在50ml三角瓶内，剪成1～2mm³的小块。

(2)用Hanks氏液(pH7．4)洗3次，直到液体清朗为止。将Hanks氏液全部吸尽。

(3)加入0．25%胰蛋白酶溶液(pH7．4～7．8，37℃)，用量为组织块的10倍左右。

(4)将三角瓶密闭，放在37℃水浴中消化，每3～4min将组织块摇匀一次。根据组织种类和动物大小确定消化时间。

(5)消化结束，吸去胰酶液，加入Hanks氏液洗一次，换加细胞生长液(约为组织块的5～8倍)，用大口吸管吹吸5～6次。静置约1min等组织块下沉，吸出分散的细胞。余下的组织块中再加生长液，重复上述步骤，直到组织块全部分散。如在三角瓶中加几颗玻珠，通过摇动使组织块分散，可替代吸管吹吸。

2．另法

(1)在三角瓶内加一外包塑料或玻璃套管的铁棒，放在电磁搅拌器上边消化边搅拌。

(2)每隔10～15min取下略等，吸取消化下来的细胞悬液装入离心管内，放在水浴中以停止消化。

(3)另加胰酶液，重复上述步骤，直到组织块全部消化。

(4)将各次收集的细胞悬液合并，即经500r／min离心10min，吸去胰酶液，将细胞沉淀用生长液悬浮。

3．冷消化——此法甚为简单，效果也较满意，为不少工作者所喜爱。具体步骤如下。

(1)组织块处理与热消化同。

(2)加入4℃胰酶消化液约10倍量，摇匀。

(3)4℃冰箱过夜(约16～18h)。

(4)取出吸去胰酶液，其余与热消化同。

(二)活细胞计数

(1)取消化分散的细胞悬液1滴与0．1%台盼蓝1滴等量混合，在室温放置4～5min。

(2)用吸管将混合液滴于血细胞计数器上，不使溢出。

(3)用10×物镜，按白细胞法计算细胞数，即将计数板4角的4个大格(每大格有16个中格)中的细胞数加在一起，按下式计算：

说明：

A．每大格的面积为1mm²，深度为0．1mm，等于1／10⁴cm³；总数／4=每大格细胞数；细胞悬液与染液等量，即稀释1倍，故应×2。

B．看到三五成堆的细胞以一个细胞计算。

C．看到大部分细胞完整分散，不着色，部分细胞三五成堆，细胞碎片很少，证明消化适度。如分散细胞很少则消化不够；细胞碎片很多，则消化过度。

二、诸种单层细胞培养的操作

(一)鸡胚成纤维细胞培养

1．取发育健康的10日龄鸡胚(如要培养鸡胚肺、肝、肾等时，胚龄必须在15日以上)。

2．将卵放在卵架上，气室向上，用碘酊消毒。

3．用灭菌镊子打破气室部卵壳，并小心除去。

4．用灭菌弯头眼科镊子撕破壳膜、绒尿膜和羊膜，夹住鸡胚头部，将鸡胚提出放于灭菌平皿中。

5．剪去翅、脚、喙和眼球，将鸡胚移入50ml三角瓶内，剪碎，用Hanks氏液洗3次。

6．用0．25%胰蛋白酶溶液(37℃)消化15～20分钟，胰酶液用量约为组织块10倍。

7．收获细胞悬液，计算细胞数，并以生长液稀释到30～50万／ml。

8．在37℃培养，24h即可长成单层(此时可换液并接种病毒，维持液中的血清可减为0．5～1．0%或免去)，3～7天可以传代，并扩大2～4倍量，但只能传4～5代，以后生长急剧下降。

(二)兔肾细胞培养(其他动物的肾细胞培养与此相仿)

1．取2周龄以下的乳兔用颈动脉放血致死，将整个兔尸用5%漂白粉液浸湿约经15min。

2．将兔尸的四脚钉在木板上固定，背部向上。木板放在搪瓷盘内。

3．用灭菌剪和镊将胸腰部皮肤先横切开，再沿体两侧向臀部纵切开，最后将皮肤向后躯剥离。

4．另换灭菌剪刀，沿背脊长肌两侧从最后一根肋骨向后剪开，使肾暴露。用止血镊夹住肾蒂，剪断，将肾取出放于平皿中。

5．将肾纵切为两半，肾蒂仍连接以便操作，把包膜剥离，将红色的皮质剪下，投入三角瓶内，白色的髓质弃去。

6．将皮质剪碎，清洗和消化。消化时间视动物幼老而异，多数在30～60min之间。短段肾小管细胞的成活率常比单个细胞高，因此在消化时要掌握适度。冷消化效果也佳。据报道用0．25%胰蛋白酶和0．02%EDTA混合消化液，细胞产量更高，死细胞更少。

7．生长液可用配方1或2，细胞浓度约为30万／ml。

8．在37℃培养3～4天即可长成上皮细胞(多角形)单层，这时即可接种病毒。维持液可用199培养液。

(三)猪睾丸细胞培养(其他动物与此相仿)

1．如无特殊要求可利用小猪阉割时的睾丸。将阴囊消毒，切开，挤出睾丸，放在平皿中。

2．用镊子夹住睾丸，以外科刀将它纵切为二，从鞘膜中挤出睾丸。

3．其他步骤与肾细胞相仿。睾丸组织很脆，而且很粘，组织块不易分散。

4．睾丸细胞生长很快，2～3天形成单层，大部分为细长的成纤维细胞，少数为上皮细胞。

(四)胎皮肤细胞培养 皮肤细胞很难分散，所以它的培养方法比较特殊。

1．采集大腿内侧的皮肤，放在平皿内用锋利的手术刀切成1mm²大小的小块，不能用钝刀或剪刀。

2．将皮肤小块移入培养瓶内，并分布均匀。

3．在组织块上压加截小的载玻片，使其与瓶壁紧贴。

4．注加生长液，在37℃培养。

5．3～5天后有细胞从组织块长出，开始为上皮形细胞，以后成纤维细胞占优势。

6．2～5周弃去组织块，细胞单层可以传代，传代后生长的全部为成纤维细胞，这种培养一般可传30次以上。

另法：组织块移入培养瓶后如不压加玻片，则可加极少量生长液，使组织块湿润但不会漂浮。培养2天后再加少量，俟细胞长出时再加较大量的生长液。