细胞培养常用试剂的配制

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第555页（2547字）

一、NaHCO₃溶液(7%)

1．将7gNaHCO₃(A．R．)溶于双蒸水中，定容到100ml。NaHCO₃的浓度按各实验室习惯可以改变。

2．用0．22μm滤膜除菌。

3．分装青霉素瓶，每瓶5ml。

4．用橡胶塞严密封口。

5．作细菌检查，证明无菌后4℃保存，有效期数月。

6．用途。调整pH和供应CO₂。

二、Hepes缓冲液

1．Hepes的全名为N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙基磺酸。

2．取Hepes47．6g溶于200ml双蒸水中，以NaOH调整到pH8．1。

3．用0．22μm滤膜除菌。

4．分装青霉素瓶，每瓶5ml。

5．作细菌检查，证明无菌后4℃保存，有效期数月。

6．用途。配制缓冲液用(pH6．8～8．2)，加1～2．5%于培养液中，即使细胞培养瓶不塞紧，pH不会改变。

三、抗生素

1．青霉素(10000 u／ml)

青霉素 800000IU

双蒸水 80ml

分装青霉素瓶，每瓶4～5ml，密封，-20℃保存，有效期1个月。

2．链霉素(10000μg／ml)——配法和保存同上。

3．两性霉素——能抑制真菌的生长，主要消除细菌培养中的真菌污染，有效浓度为2～5μg／ml。这种抗生素对细胞有毒性，因此浓度宜小不宜大，而且在发现污染时才添加。配法是50mg溶解于双蒸水50ml中，分装于青霉素瓶中，贮存于-20℃，一个月内有效。

4．制霉菌素(10000u／ml)——能抑制真菌的生长，特别是酵母，有效浓度为25～50u／ml。用途、用法和保存与两性霉素同。

5．金霉素(10000μg／ml)——能抑制霉形体的生长，在发现细胞培养被污染时使用，有效浓度为50μg／ml。

6．卡那霉素(10000μg／ml)——可代替青霉素和链霉素，或者发现污染菌对这两种抗生素有耐药性时可改用卡那霉素，有效浓度为50μg／ml，如浓度达到200～400μg／ml也能抑制霉形体。卡那霉素能耐高温，可配在培养液中高温灭菌，不必临时加入。

7．庆大霉素(10000μg／ml)——与卡那霉素同。

四、酚红溶液(1%)

1．取酚红1g放置研钵中加双蒸水24．5ml和4%NaOH5ml，仔细研磨，直到完全溶解，加双蒸水到100ml。

2．用滤纸过滤。

3．装瓶，避光4℃保存。

五、胰蛋白酶溶液(0．25%)

1．取胰蛋白酶(1∶250)1g加于Dulbecco氏PBS的A液400ml中，强烈摇振使溶解。

2．加1%酚红0．6ml，和滴加4%NaOH将pH调到7．4～7．8。

3．用滤纸过滤几次使澄清。

4通过5号玻璃滤器或0．22μm滤膜除菌。

5．分装20ml玻瓶，-20℃保存，有效期3～6个月。

注意：

(1)用Hanks氏液溶解胰蛋白酶不如PBS-A液，因为Ca和Mg离子对细胞分散不利。

(2)用NaHCO₃调整pH不如用NaOH，因为在37℃消化时CO₂会逃逸。

六、EDTA(0．02%)

又称Versene，是一种络合剂，主要用于细胞传代时使细胞从玻面上脱落下来。

1．取EDTA0．1g，溶解于PBS-A液500ml中。

2．加1%酚红0．75ml。

3．分装，每瓶20ml，密封。

4．121℃高压蒸气灭菌15min。

5．4℃保存，半年有效。

七、台盼蓝溶液(0．1%)

能使死细胞染色，用于活细胞计数。染色时溶液中不应含有可溶性蛋白。配制方法是取台盼蓝0．1g溶于100mlPBS(pH7．3)中，滤纸过滤，室温贮存。

八、结晶紫-枸橼酸溶液(0．1%)

此液能染色细胞核，不分细胞的死活，有完整的细胞浆和膜才是活细胞，主要用于细胞计数。配制方法是取结晶紫0．1g溶于0．1mol／L枸橼酸100ml中，滤纸过滤，室温贮存。