接种途径
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第534页（5623字）
一、绒尿膜(CAM)接种
此法除用于病毒的分离和繁殖外，对于某些在此膜上产生局部性病损的病毒来讲还可用于病毒的滴定。在此膜上生长的病毒包括痘病毒、疱疹病毒、正粘病毒、副粘病毒等各科的多种病毒。绒尿膜接种有两种方法，下面分别叙述。
(一)A法(人工气室法)
1．用9～10日龄胚胎，照卵，用铅笔画出气室区和接种部位。适宜的位置应是CAM发育良好，但无大血管处，一般在胚胎邻近。
2．在气室和接种部用70%酒精消毒，消毒面积不宜超过1cm2。也可用酒精-丙酮等量混合液消毒。
3．用一5～6cm长的木螺丝钉，尖端以酒精灭菌，在气室和接种部各打一小孔。木螺丝的优点是容易刺破卵壳和壳膜，但不会刺破绒尿膜。(注：过去都将接种部的卵壳锯破，开一正方形或三角形的口子，以便制备人工气室。此法甚烦，不能用于大量样品)。
4．用橡皮乳头将天然气室处的空气吸出，横径上接种部的绒尿膜即下陷，形成人工气室。如样品很多，可用微形抽气机连接橡皮管以替代橡皮球。
5．将卵放在卵架上。
6．用结核菌素注射器吸取接种样品，将针头(一般用5～51／2号)呈30度插入人工气室，针面向下，慢慢注入样品0．1～0．2ml。如接种卵数量多也可用连续注射器。
7．用融化石蜡将两孔封闭。
8．将卵在35～37℃定温箱中培养，人工气室向上。24h照卵一次，弃去死胚，以后每天照卵2次，将死亡的鸡胚贮于冰箱内等待检查，未死者按病毒特点到规定时间冻死后检查。
9．病毒收获检查鸡胚前通常将卵在4℃冷冻过夜，使血管收缩而防止出血。也可在-20℃放置30min，但注意不能结冰。
绒尿膜的收获可在人工气室或天然气室处用碘酊消毒，待干后用消毒镊子将壳击破除去。用剪将绒尿膜剪下，移放平皿中。用大口吸管吸取尿囊液和羊水，倒出鸡胚和卵黄，再将紧贴在壳膜上的绒尿膜全部移放平皿中，铺开，详细检查病损。如平皿下有照明灯，则病损会显得更加清晰。
如果需要传代，可将膜剪碎，加少量胚液后磨匀。如将膜在-60℃冷冻后取出融化，经离心，取上清液即可作为接种之用。
图27-2 鸡胚绒尿膜接种A法(人工气室法)示意图
将接种材料滴在人工气室的CAM上虚线表示原先的壳膜位置；小箭头表示绒尿膜移动方向
10．非特异性病损 卵经过清洗、卵壳用碘酊消毒、打孔等操作，可能会导致出现非特异病损。它们通常见于打孔处，沿着血管，分布不匀或聚集成丛。如果有一个经同样处理的对照组即可识别。
(二)B法 此法技术很简单，是用针头刺破壳膜和绒尿膜，将样品滴在气室内的壳膜上，令其慢慢渗透到气室下面的绒尿膜上。本法的原理是壳膜是脆的，刺破后不能再闭合，而绒尿膜有弹性，当针头拔出后被刺破的小孔立即又闭合。具体步骤如下。
1．照卵，画出气室区。
2．将卵放置卵架上，气室向上(如气室在边上，此卵弃去不用)。
3．气室区中央消毒，打孔。
4．将针头刺入卵壳约0．5cm，滴加样品0．1～0．2ml。
5．将针头继续刺入约1．0～1．5cm。
6．拔出针头，样品液即慢慢渗透到绒尿膜上。
7．将孔用融化石蜡封口，气室向上，在温箱中培养，几小时后即可任意放置。
8．以后步骤与A法同。
图27-3 鸡胚绒尿膜接种B法
黑线针头为第一次刺入深度
虚线针头为第二次刺入深度
二、尿囊腔接种法
此法技术简单，在鸡胚接种中最为重要和最为常用，大量生产某些病毒时常用此法，如流感病毒、新城疫病毒和其他副粘病毒等。
病毒接种到尿囊腔内后在尿囊内皮细胞中繁殖，随后又释放到尿囊液中，因此可从尿囊液和尿囊膜回收病毒。
尿囊腔接种一般应用9～10日龄鸡胚，方法有两种。
(一)A法
1．照卵，画出气室区。气室不在大头的卵均能应用。
2．在气室边缘上端3～5mm处用70%乙醇或碘酊消毒，打孔(只打一个孔)。
3．用结核菌素注射器，配以5或6号针头自气室向卵长轴约30度刺入10～12mm，注入样品液0．1～0．2ml。
4．用融化石蜡将小孔封闭。
5．35～37℃培养，每天照卵二次，将24h以后死亡的鸡胚暂存冰箱内，经18～24h取出检查。如果病毒不能使鸡胚死亡，则培养规定时间后放入冰箱冻死，然后检查。
6．胚液收获时可将卵垂直放于卵架上，气室部用碘酊消毒，用镊子除去该部卵壳，另换镊子小心撕去壳膜，接着撕破绒尿膜。术者左手持摄子将胚胎压向一侧，右手用大口吸管吸取尿囊液，每个胚可收获5～8ml。也可不撕破绒尿膜，直接用10ml注射器连接针头刺入尿囊中吸取。如果卵很多，可将吸管用橡胶管连接抽滤瓶吸取胚液。
图27-4 尿囊腔接种的两种途径示意图
(二)B法
1．照卵，画出气室区。选择有绒尿膜部位，但不要太靠近胚胎和大血管，离气室约5mm左右处较宜，用铅笔作一记号。
2．在气室和绒尿膜记号处消毒，各钻一小孔。
3．用A法的注射器插入约5mm，随即注入样品液0．1～0．2ml。
4．用石蜡封孔。
5．其余同A法。
三、羊膜腔接种法
此法的技术比较困难，因此应用较少。接种的病毒在羊水中不但能接触羊膜和胚胎皮肤的上皮细胞，而且通过胚胎的吞咽运动，也能接触消化道和呼吸道的细胞。此法可用于某些病毒的初次分离，如多种粘病毒和披膜病毒等。8～12日龄的鸡胚均可应用，如无特殊要求，一般用12日龄的胚。羊膜腔接种有两种方法，均须在暗室中进行。为了使胚胎位置靠近气室，最好在接种前晚将鸡胚垂直放置，大头向上。
(一)A法(开窗法)此法比较多用，但操作较复杂。
1．照卵，画出气室区，并用碘酊消毒。
2．在气室中央锯一圆形或方形孔，直径约10～15mm。
3．用尖头镊子轻轻撬去卵壳，不使其破碎。
4．在壳膜上滴2～3滴灭菌生理盐水，并使其铺开，几分钟后壳膜湿润而变透明。
也可用1小滴灭菌液体石蜡代替生理盐水，这样壳膜的透明度更佳，但石蜡不能太多，如超过壳膜面积的1／4，即妨碍鸡胚呼吸而导致死亡。
5．鸡胚下放一照卵灯，使灯光向上照射，术者自上向下即可看到鸡胚活动。
6．用4cm长的5～6号针头垂直刺下到羊膜腔内，注入样品液约0．1～0．2ml。为了确切知道位置是否正确，可将针头稍稍拨动鸡胚来证明。由于羊膜弹性较大，不易穿透，因此刺入时动作要快，但要避免刺伤胚胎。
7．将卵壳放回原处，用石蜡封闭裂缝。也可用胶布将锯下的卵壳与卵本身固定以防其陷下。
8．培养和检查如前。
9．羊水收获胚龄越大羊水量越少。接种病毒后也常使羊水减少而收获困难。此外病毒生长有时使羊水由无色水样变成淡黄色而粘稠。收获方法有两种。
一种是打开气室，撕破绒尿膜，吸去尿囊液，用镊子夹住羊膜囊，将针头或吸管刺入吸取羊水。
一种是吸去尿囊液后将鸡卵慢慢倾斜，这样羊水流向前端而使羊膜囊突出于卵壳外。这时用针头自上向下刺入吸取。也可在下面剪破而使羊水流入小瓶内。如果需要，也收集羊膜本身。
(二)B法(盲刺法)此法较简便，但成功率低。
1．照卵，画出气室区。
2．将卵放在灯光向上照射的卵架上，将卵转动使胚胎面向术者。
3．在气室顶部到边缘的一半处打一孔，用40mm长的针头垂直插入，深约30mm以上。如已刺入羊膜腔，能使针头拨动胚胎，这时即可注入样品液0．1～0．2ml。如针头左右移动时胚胎随着移动，则针头已刺入胚胎，这时应将针头稍稍提起后再注射。
图27-5 羊膜腔接种示意图
A．针头刺入触及尿囊一羊膜(此膜弹性很大)B．针头向右移动C．形成一个折皱D．针头呈45°刺入羊膜腔
4．拔出针头，用石蜡封闭小孔。
5．培养、检查、收获见前。
四、卵黄囊接种法
此法主要用于培养立克次氏体和衣原体，某些病毒如几种披膜病毒、几种粘病毒、狂犬病毒等也可应用此法。一般应用6～7日龄的鸡胚，方法简单，简述如下。
1．照卵，画出气室区和胚胎位置。
2．接种病毒，有三种方法。
(1)在气室中央偏离胚胎5mm处消毒后打孔，用35～40mm针头垂直刺入约达卵长径的1／2处接种样品液0．1～0．5ml。
(2)在胚胎对面，气室边缘上面5mm处消毒打孔，将针头呈60°刺入达1／2长径处(30～35mm)接种。
(3)在胚胎对面，长径1／2处打孔，针头刺入12～15mm处接种。
图27-6 卵黄囊接种法
上述三种途径均易成功，但为了证实位置正确，接种前可将注射器稍吸一下，检查是否有卵黄流入针筒。
3．用石蜡封闭小孔。
4．培养和检查见前。
5．卵黄囊的收获有2种方法。
(1)气室区的卵壳消毒后打开，除去壳膜，把整个鸡胚内容物倒在灭菌平皿中。将卵黄囊蒂剪断，用镊子提起卵黄囊，刺破使卵黄流尽，再在PBS中洗去残余卵黄后作进一步处理。
(2)气室区的卵壳和壳膜除去后撕破绒尿膜和羊膜，用弯头眼科镊夹住鸡胚头部将其提出，再夹住卵黄囊蒂。其余同上。
五、脑内接种法
此法甚为少用，操作可按羊膜腔接种法。
六、静脉内接种法
此法也甚少用。用12～14天鸡胚，照卵，选择一条粗大而固定的血管，用铅笔作出记号。沿血管将6×12mm一块卵壳锯破撬去，注意不能破损壳膜。加1滴灭菌液体石蜡使其透明。此时即可接种。
七、无胚蛋接种法
此法比较常用，即将12～14天龄鸡胚全部内容物倒出而令绒尿膜仍贴附在壳膜上。接种样品后加细胞培养液，封闭卵壳，用转管法培养。