痘病毒科
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第648页（2589字）
痘病毒是一群最大型的病毒，病毒子多数呈砖形，只有副痘病毒呈卵圆形，大小约为300～450×170～260nm。病毒子内有一个含有单分子双股DNA的哑铃状芯髓，其两侧各有一个侧体，衣壳由管状结构的蛋白质组成，并含有脂类。脊椎动物痘病毒的抗原成分颇为复杂，但各成员都具有核蛋白抗原—NP。痘病毒嗜好感染上皮细胞，在细胞胞浆内增殖并形成胞浆内包涵体，内含有许多病毒子，旧称原生小体。
根据痘病毒的宿主范围、血清学反应和病毒子的形态特征，将痘病毒分为脊椎动物痘病毒亚科及昆虫痘病毒亚科，前者分六个属。同属内各成员间存在着许多共同抗原和广泛的交叉中和反应，只有正痘病毒产生血凝素。
表38-1 脊椎动物痘病毒亚科各属的主要特征
一、样品采集
痘疱液、痘疹皮、痂皮或死亡动物的肝、脾都含有大量痘病毒。鼠痘则可采取肠道粘膜或尾部表皮。
分离病毒时痘疹皮、痂皮等需先磨碎，加入5倍量含抗生素的Hanks液，充分混匀后放置4℃冰箱内2～4h或过夜，然后以2000r／min离心沉淀10min，取上清液作分离病毒用。
二、显微镜检查
(一)病毒子形态观察 痘病毒形体较大，光学显微镜下勉强可见。因此，可将痘疱液或丘疹组织做成涂片，晾干后按莫洛佐夫镀银染色法：即(1)用卢盖氏液(冰醋酸1ml，40%甲醛液2ml、蒸馏水1000ml)固定1～2min，倾去液体；(2)充分水洗；(3)滴加媒染剂(鞣酸5g、石炭酸1ml、蒸馏水100ml)，徐徐加热至出现蒸气时为止(约1min)；(4)水洗；(5)滴加镀银液(蒸馏水100ml)滴加10%硝酸银2～3滴、振荡后加入25%氨水1～2滴)，徐徐加温1～2min，直至涂片成明亮的棕色为止，(6)水洗、干燥、镜检。背景为淡黄色，在胞浆内有深褐色球菌样圆形小颗粒，单在、成双、短链或成堆，即为原生小体。
在有条件的单位，采取水疱液以磷钨酸负染色后作电镜检查，可以看到典型的痘病毒子，这是最迅速且准确的一种诊断方法。
(二)包涵体的检查 将病变部作成切片或将出现细胞病变的细胞培养固定，染色后置高倍镜或油镜下观察。大多数痘病毒在感染细胞内可形成一个或多个圆形或卵圆形胞浆内包涵体。它可分为两个型，即(1)B型包涵体：Feulgen染色阳性，姬姆萨染色时呈红紫色，苏木紫—伊红染色时呈蓝色。(2)A型包涵体：Feulgen染色阴性，姬姆萨染色时呈淡青色，苏木紫—伊红染色时呈深亮红色，周围绕有清晰的晕。A型包涵体一般出现于B型包涵体之后，后者含有成熟的子代病毒颗粒。
此外，牛痘、猴痘、牛丘疹性口炎及禽痘等病毒还会形成核内包涵体。
三、病毒分离
(一)细胞培养 各种痘病毒在原宿主细胞(肾、胚胎组织及睾丸等)、鸡胚细胞、人胚肾细胞及Hela细胞等培养中均可生长，常用于病毒分离。感染细胞变圆、融合及形成空斑。胞浆中可出现嗜酸性包涵体。鸡胚原代细胞作痘病毒空斑观察，常能取得满意的结果。
(二)鸡胚接种 多数畜、禽痘病毒能在鸡胚绒尿膜(CAM)上生长，形成痘斑或结节性病灶。将待检材料0．1～0．2ml接种在CAM上，置35～37℃孵育约72h，CAM上会产生痘斑，3～5天使鸡胚致死。
(三)动物试验 各种痘病毒划痕接种于本动物的皮肤上后，能引起与自然病例相似的痘疹。实验室中兔、豚鼠、仓鼠等可用于痘病毒的分离。划痕接种兔眼角膜，可使划痕处发生透明增生。切下角膜制备标本，染色后可发现胞浆包涵体。如将角膜用升汞和酒精固定，可见明显的圆形浑浊斑点。
四、血清学试验
(一)中和试验 按常规方法进行。用已知的高免血清，分别与被检样品混合，37℃感作1～2h后，接种于细胞培养或鸡胚绒尿膜上，随后检查细胞培养的细胞病变或CAM的痘斑。
(二)补体结合试验 常采用痘泡液作抗原与已知高免血清进行试验。如系痂皮，则取1g置干燥缸内干燥，用玻璃砂磨细，并加5ml乙醚振荡10分钟，静置片刻，吸去乙醚，置37℃加速蒸发。然后用生理盐水将磨细的痂皮作1∶20～1∶50稀释、室温浸渍2h，不时振荡，然后以1500r／min离心15min，吸取上清液，58℃加温30分钟作为待检抗原。
(三)琼脂扩散试验 应用痘泡液作抗原，与已知高免血清进行试验，通常在24小时内出现特异性沉淀线。
(四)血吸附和血吸附抑制试验 正痘病毒具有血凝素，一般先在小瓶内培养敏感细胞，待长成单层后，按常规方法接种病毒和检验。由于血凝素是痘病毒感染细胞后合成的早期蛋白质，因此是一个较好的快速鉴定方法。
血清学诊断中，中和试验的特异性较高，可以测出各个种或株之间的微小差异。
五、病毒复活试验
这是一种与遗传重组无关的非基因性再活化现象，是痘病毒的一种特殊互补形式，能在各个成员之间进行，可用于判定待检病毒是否属于痘病毒。常用痘苗病毒作试验，方法是将已知能在CAM上产生痘斑的痘苗病毒放置55℃灭活2h，将此灭活病毒与等量待检病毒混合后接种在CAM上。另设二组对照：(1)单独接种不灭活痘苗病毒，必须出现痘斑；(2)单独接种待检病毒，必须不出现痘斑。如果已灭活的痘苗病毒能复活并产生典型的痘斑病变，则待检病毒即可判定为是痘病毒。原理是当痘苗病毒受热时，病毒的酶被灭活，而不能脱壳，此时DNA虽不受热的损害，但被困在病毒芯髓内。若另一种痘病毒能够补给此酶，则DNA就能释出并开始复制。