轮状病毒属
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第702页（2727字）
本属病毒，是多种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原之一。本病毒呈球状，直径65～70mm，具有双层衣壳。核酸为双股RNA，分成11～12个节段。对乙醚、氯仿等有机溶剂不敏感。本属有许多成员，分别感染马、牛、山羊、绵羊、猪、鹿、猴、犬、兔、鸡、火鸡、小白鼠和大白鼠等动物。它们具有一共同的属抗原。所有成员的实验室诊断步骤基本相同，现将几种常用的检验方法介绍如下：
样品采集，急性肠泻病畜的粪便或小肠后段内容物。
(一)病毒分离——主要应用细胞培养 轮状病毒的分离培养是比较困难的，而且困难程度随毒株的不同而异。初代分离培养可以试用猪肾、MA104细胞系、犊牛肾和牛胎肠上皮细胞，鸡轮状病毒可用鸡胚细胞和鸡胚肾或肝细胞。
1．以PBS(0．15mol／L，pH7。6)将病料制成1∶5悬液，冻融1～3次。
2．以6000r／min离心30min，收集上清。
3．加入青链霉素各1000IU／ml，再经0．3μm微孔滤器除菌。
4．于上述滤液中加入5～20μg／ml胰酶，37℃作用15～60min，接种细胞单层(接种病毒后的细胞单层用2500r／min离心1h，可以提高轮状病毒的分离率)。
5．37℃吸附1h，吸去接种液，加入维持液(含胰酶1～5μg／ml)，36℃培养，每48小时更换维持液。逐日观察CPE。
6．传代时将感染细胞冻融2次，或用超声波或胰酶处理，按同法接种细胞。
除某些牛毒株外，其他动物的轮状病毒在细胞培养中增殖时，一般不产生CPE，或很轻微，且易在传代过程中消失。CPE表现为细胞肿大变圆，核周围出现空泡，胞浆内有包涵体，最后细胞大量脱落。无论分离的毒株产生病变与否，都应用免疫荧光法检测细胞培养中的病毒。
(二)电镜检查
1．按上法处理粪悬液，但不加抗生素，不用胰酶处理。
2．以38000r／min离心90min，倾弃上清液，将沉淀物悬浮于数滴蒸馏水中，滴加在铜网上。
3．用磷钨酸钠溶液作负染色，电镜检查。
如果粪汁中的病毒子太少，可用密度梯度离心法进一步浓缩上述悬液。
呼肠孤病毒也可引起腹泻，它和轮状病毒形态相似，观察时应注意区别。
1．轮状病毒内衣壳的壳粒为棍棒状，向外呈辐射状排列，外衣壳清晰光滑；呼肠孤病毒内衣壳的壳粒接近球形或呈短棱柱状，外衣壳表面呈粗糙颗粒状；
2．轮状病毒的核心较小，直径为37～40nm，而呼肠孤病毒的核心为40～45nm。
(三)核酸电泳——此法灵敏度高，已成为常规技术
1．粪样处理——取粪若干克(粘稠的粪样用PBS稀释)，冻融3次，6000r／min离心30min，收集上清液。
2．病毒核酸提取
(1)于上清液中加入含10%十二烷基磺酸钠(SDS)的0．1mol／L醋酸缓冲液(pH5．0)，使SDS最终浓度为1%，强烈振荡20min。
(2)加入等体积苯酚溶液(苯酚500g、甲酚70g和含0．5g8-羟基喹啉的水200ml，振荡30min，然后4000r／min离心30min，吸取上部水层。
(3)加入等体积氯仿溶液(氯仿与异戊醇之比为24∶1)，振荡30min，再以4000r／min离心20min，吸取上部水层。
(4)加2倍体积的无水乙醇，置-20℃沉淀2h或过夜。以3000r／min离心30min，弃上清液，用少量蒸馏水溶解病毒核酸沉淀，-20℃冷冻保存。
如上述处理不能获得清亮的水相层，可重复用苯酚、氯仿溶液处理。
3．PAGE——按常规进行垂直或水平平板核酸电泳。聚丙烯酰胺的浓度为7～10%，胶厚1～1．5mm，10～20mA稳流电泳15～60h。
4．硝酸银染色——电泳后的凝胶经10%乙醇和0．5%乙酸固定30min，用0．185%硝酸银染色30～60min，以蒸馏水洗去多余的硝酸银液，将凝胶放入显影液(3%NaOH，0．76%福尔马林)5～10min，定影用5%醋酸，蒸馏水洗后，拍照或用玻璃纸密封保存。
在轮状病毒核酸电泳图式上可清晰地呈现出11～12核酸条带。电泳型有长型和短型之分，长型的第10、11片段泳动快于短型的。不同毒株核酸的图式有一些差异，但一般都分成4个区，呈4、2、3、2分布。引起动物腹泻的另一个核酸分节段的病毒是呼肠孤病毒，其核酸电泳分为3个区10个条带，不难区别。
(四)ELISA间接双抗体夹心法 WHO已将此法列为诊断轮状病毒的标准方法。此法比较简便、灵敏，国内外已有诊断试剂盒出售。应用抗轮状病毒的单克隆抗体(McAb)使ELISA的敏感性得到进一步提高，而且型特异性的McAb可以对粪便样品进行分型研究。
除以上方法外，还有放射免疫测定、对流免疫电泳、免疫荧光染色、菌体协同凝集试验、核酸杂交等方法可以用于临床诊断。而传统的中和试验和补体结合试验等在临床上已不使用，而只用于分离病毒的分型研究。由于轮状病毒分布很广，抗体检测意义不大。