器官再生的技术程序
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第32页（5565字）
(一)植物栽培
母体植物的年龄和生理状态可为细胞培养物器官发生的成功作出贡献。当然，外植体来源决定植株的年龄。叶外植体应从年幼的开花前的植株取材，如烟草，但玉米培养物常从幼胚发生。当然所用的植株必须是尽可能幼嫩和健壮。从植株到培养物转变是一种胁迫，成年的和衰老的植株可能不能忍受这种转变。树木组织培养，起始培养物年龄的重要性特别明显，这些植物通常只能从年幼的组织发生愈伤组织，而不是从成龄树上取的外植体。
成功地诱导产生培养物也与母本植物是生长在温室或田间有关。在温室中较易控制植物的发育，因水和温度容易进行监测和控制。此外，由于易控制病害和环境清洁，使得较易从温室生长的植株建立无污染的培养物。显然，对有些植物在温室栽培是不现实的，如大树和其它多年生植物。
季节也影响外植体的愈伤组织诱导，尤其当供体植物生长在田间时，曾经有人观察过内源生长素浓度的季节性变化，在马铃薯建立的分生组织和松柏类的培养物中也曾有过报道。对这些植物在春天或夏天发生培养物是最合适的。在培养时植株的发育阶段和生理状态必须考虑，因为形成层和侧芽的休眠、花诱导等因子会影响初始培养物的反应和成功。
(二)外植体
从多种植物的离体培养物建立了愈伤组织及此后的器官发生和胚胎发生。大多数活的植物细胞都可在离体培养中诱导发生有丝分裂，从多种外植体可以建立愈伤组织，和再生植株(表1-15)。对于某一种或变种，为再生植株可能需要特定的外植体，如禾谷类植物需要胚性组织。包含有茎尖或分离的分生组织的外植体，对于建立愈伤组织及此后的植株再生是特别成功的，因为它们含有有丝分裂上活跃的细胞。无论是从成熟器官或幼嫩器官所取的外植体都能直接再生，或在适宜的培养基上先增殖或形成愈伤组织后再生植株。外植体的大小和形状可能是重要的。外植体较大就增加了外植体中细胞的数目，也增加了得到活的培养物的可能性。Yeoman(1970)曾指出，胡萝卜根和菊芋块茎外植体的临界大小反映了细胞的大小。这两种情况下，适宜的外植体应含有20一25000个细胞。
(三)培养基
植物细胞培养基的必要成分已有总结。MS培养基含有以铵的形式供给的高浓度的氮，而White培养基是没有铵的。因为铵浓度高会使一些植物系统的细胞生长变慢，因此难把细胞从White、B5或SH转移至MS培养基。White培养基是一低盐培养基，而其它三种都属于高盐培养基。SH与B5相似，只有一些盐的浓度稍高一点。在植物再生中也用LS培养基。LS和MS培养基的大量与微量营养成分是一样的。其区别只表现在维生素和有机附加物浓度不同。对于MS培养基的有机附加物的改变也有报道。有机附加物有碳源和维生素。蔗糖用作碳源，但也可用葡萄糖取代之。其它糖使用较少。常加维生素、肌醇、烟酸、吡哆醇、硫胺素、泛酸钙和生物素等。硫胺素是植物生长所需要的，而其它维生素可以促进某些系统的生长。维生素E可以调节细胞的聚合，而维生素D可以加速根的形成。有时也把各种植物的提取物和未知成分的附加物加入培养基，以促进细胞生长。
(四)培养物的保持
培养物的保持决定于是否能保留其再生的能力。保持形态发生潜力的最重要的因素是保持染色体的稳定性。
在长期的细胞悬浮培养体中，植物染色体数目的变化已得到充分的证明。在细胞悬浮培养物和愈伤组织培养物中染色体的变异已经进行了广泛的综述。有人提出，在培养细胞中逐渐增加的变异是与其逐渐失去器官发生能力成正比的。Murashige和Nakano(1967)曾指出，非整倍体烟草成苗能力严重下降，但Saeristan和Melchers(1969)指出可以比较容易地再生许多非整倍体的烟草。不幸的是悬浮培养细胞的染色体的不稳定性，只在少数情况下，与再生的植株的细胞进行过比较，再生植株中的染色体的变异性总比从其再生的愈伤组织少；然而，尽管在愈伤组织培养物中有许多种染色体数目，但从胡萝卜、水稻、扁桃和小麦只能再生二倍体植株。这些种的体细胞的染色体数目扁桃为2n=2x=16，而小麦为2n=6x=42。因此，在这些植物的再生条件下，二倍体是选择性的有利于这些种的。Orton(1980)把大麦、芒麦草和它们的种间杂种的愈伤组织培养体和悬浮培养物的染色体数目与从这些培养物再生的植株的染色体数目进行了比较，在所有情况下，多倍体和数目大大减少的非整倍体愈伤组织细胞都不能再生植株。相同的染色体数目还不足以肯定遗传上的稳定性。只有从麝香百合的长期培养物再生的植株证明具有正常的核型。已经从包括烟草，麝香百合的许多培养物得到多倍体植株，从Pelargonium得到了单倍体。从花药再生的植物中多倍体是很普遍的，不论是直接再生的或是通过愈伤组织再生的。从多种植物得到了各种非整倍体植株。从三倍体(2n=3x=21)黑麦草杂种的愈伤组织再生出染色体数目减少的植株，然而，从甘蔗和烟草得到各种非整倍体和染色体数目减少的植株。这些染色体的变异都与表型的变化有关，也包括农业上有用的性状，如抗病性、与非整倍体有关的变异，如果不是伴随降低产量的话，那么对于营养繁殖的作物特别有价值。从原生质体再生的植株和大多数体细胞杂种植株，可观察到非整倍体和形态学的变化。
在烟草属，大麦属，小麦属，甘蔗属和Lycopersicum peruvianum中报道过染色体数目镶嵌的再生植株。在再生植株中染色体镶嵌现象的普遍性表明，植物体是由两个以上的细胞起源的，或者新的染色体变异是植株再生以后在体内发生的。在由原生质体融合产生的体细胞杂种中也报道有体细胞镶嵌现象，人们假定这种植株是从一个细胞产生的。曾有人提出，再生植株的染色体数目镶嵌现象在再生植株以后发育成成熟植株的过程中逐渐减少了。但这种镶嵌现象可发展成周缘嵌合体或周缘区分嵌合体或传给后代。在再生植株体内保持染色体镶嵌现象可能受遗传控制。
Erans和Gamborg(1982)曾经指出，继代的频率会影响细胞培养物染色体的稳定性。为保持染色体的稳定性，培养物必须经常继代，如烟草每3—4天继代一次。由于频繁的继代，在细胞培养体中不能累积非整倍体细胞。细胞在晚对数生长期转移，从不进入稳定生长期。因为在继代时，细胞并无迟滞期。用频繁继代方法，一个烟草的悬浮培养物已经保持5年以上，其染色体数目正常，2n=48，并保持了再生正常植株的能力。
细胞培养常用的二种方式：(1)在固体培养基(如琼脂、明胶、滤纸或微孔滤膜)上培养细胞丛，(2)在液体培养基中的悬浮细胞培养物。发生新的培养物，最好用固体培养基，因为如果把小块外植体放入大量的液体培养基中，一些必须的营养可能很快会发生缺乏。通常用把易碎的愈伤组织放入液体培养基的方法建立悬浮细胞培养物。悬浮培养物通常包含游离细胞和2—100个细胞组成的团块。当培养物已达到最好生长速度和遗传稳定性以后，应增多继代频率。
(五)植株再生
Skoog和Miller(1957)第一次指出，培养基中生长调节剂的浓度是控制生长和形态发生的关键。一般讲，培养基中生长素浓度高，而细胞分裂素浓度低，则促进大量的细胞增殖，并形成愈伤组织。通常发生愈伤组织可以单用2，4-D。另一方面，在培养基中生长素浓度低和细胞分裂素浓度高，结果诱导苗形态发生。在诱导根原基形成时，可只用生长素或同时加入极低浓度的细胞分裂素。
从细胞悬浮培养物和愈伤组织培养物都可诱导器官发生。在大多数例子中，是把细胞从生长素浓度高的培养基转移至细胞分裂素浓度高的再生培养基。苗几乎总是在固体培养基上再生的。从悬浮培养物再生苗通常更加有效，如果先把细胞在有再生生长调节剂(如高浓度细胞分裂素)的悬浮培养基中继代1—2次，在再生培养基中继代培养以后，降低生长素浓度，在固体的再生培养基上再生苗更加有效。
(六)烟草器官发生的程序
在离体培养中研究再生，曾经用烟草作为一种模式系统，因为Skoog和Miller(1957)的经典研究，这是器官发生的一些基本相关性已经得到阐述的少数系统中的一个。
下面是用于烟草叶外植体器官发生的程序：
1．植株可在通常的温室中栽培，但必须在开花前用。在太阳升起后1—2h或从暗预处理的烟草植株采集充分展开的幼嫩叶。
2．用温和的清洗剂在水中清洗叶，先用70%酒精淋洗，再用蒸馏水淋浇。
3．用市售的20%次氯酸钠溶液把叶灭菌20分钟。必须把全部叶表面浸入灭菌液中。通常是把叶子放入一个小烧杯中，再把烧杯放在一个回旋振荡器上。
4．用无菌水洗三次，让其干燥约5min。
5．把叶子切成1×lcm小块，接入培养基。
6．为形成苗，叶外植体应接入含有1—5μM6BA的基本MS固体培养基上。在3—4周内应出现苗。
7．如果要形成愈伤组织，应把叶外植体接在含有4．5μM2，4-D和1—2g／1水解酪蛋白的MS培养基上。在4周内应形成愈伤组织。
8．培养物应放在光下(约1000lx)，每天照光12—24h。在22—28℃下生长对成苗和形成愈伤组织都合适，也就是说在大多数情况下，培养温度应进行调节。
9．当出现幼嫩的苗时，应把其转移至生根培养基。在没有激素或浓度减半的MS培养基上可以形成根。
10．生根的植株可移栽到花盆中，在移栽后的头几天湿度要高。
除了上述程序中所提到的直接再生植株外，烟草还可通过愈伤组织或细胞悬浮培养物再生植株。如果是在含有2，4一D的培养基中发生和保持愈伤组织，那么为得到苗需用细胞分裂素代替2，4一D。从烟草的长期细胞悬浮培养物也用这种方式再生了植株。在烟草再生植株方面，不同研究工作者试过各种生长素和细胞分裂素的组合。
烟草属的离体培养操作的一般程序，可以用于许多作物，以发展一个新器官发生的细胞培养系统。最多的变化是：(1)供体植物的栽培，(2)外植体的来源，(3)培养基，(4)用于诱导愈伤组织的植物生长调节剂的浓度，(5)保持愈伤组织的生长调节剂的浓度，(6)再生植株的培养条件。最重要的是，这些都不是孤立地变化的，本质上它们都是相互作用的。
【参考文献】：
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