原生质体游离用的酶
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第62页（2966字）
植物细胞壁不是一个生理学载体，而是大多数高等植物难以克服的机械界线。在渗透压变化时，细胞壁保护原生质体的外膜，防止微生物入侵。细胞壁还妨碍大多数细胞遗传饰变。植物细胞壁的三个基本成分是纤维素、半纤维素和果胶物质。纤维素的含量范围是占燕麦胚芽鞘细胞壁干重的25%到幼棉纤维的50%。纤维素是线状的用β-1，4键连接的D-葡萄糖多聚体，纤维素的分子量在不同种间变化在50000—25000000之间。当纤维素酶水解时，细胞壁的这个组分产生纤维二糖和直到完全水解为葡萄糖。半纤维素不很确定，它是葡萄糖、半乳糖、甘露糖醇、阿拉伯糖和本糖的混聚体。多数碳水化合物是靠β-1，4和β-1，3键连结的。细胞壁平均由53%半纤维素组成约5%的初生细胞壁，它在细胞壁结构和植物细胞间建立连结方面起重要作用。果胶是用α-1，4键连结的甲基-D半乳醛酸的多聚体，其分子量在25000—360000之间。另外，细胞壁含有延伸素，它是附着在纤维素分子上的一种复杂糖蛋白和很多未确定脂类。
Cocking(1960)首次用酶法释放出原生质体，即用水解酶抽提液从番茄根尖游离出原生质体。自此以来，有很多酶制剂用于游离原生质体，目前多数已采用商业性的水解酶类。多数酶是从微生物中分离得到的，这些分离出的酶对植物细胞壁的不同成分有作用。因此，当试图从一种新植物或组织释放原生质体时，需要改变每种酶的有效浓度和比率。
纤维素酶和半纤维素酶的来源对原生质体的释放是极重要的。纤维素酶(Onozuka)R10是从Trichoderma reesei(以前叫T．viride)类型部分纯化得到的，Kinki Yakult公司(日本)和Calbiochem公司(美国)的商业性可采用的酶制剂，同时含有纤维素酶和半纤维素酶活性。这个酶在原生质体游离方面用得最多。产生纤维素酶的微生物都能以纤维素作为唯一碳源而能在纤维素上生长。纤维素酶是具多种独特活性的复合性。用柱层析法可分离出对纤维素水解所必需的两种成分。C1成分主要是一种解键酶，而CX成分负责随后分解多聚体成葡萄糖。两种成分协同作用解降纤维素。
半纤维素酶对难游离的组织也是必需的。采用最多的半纤维素酶是Rhozyme、Hp150(表3-1)在多数原生质体游离程序也使用果胶酶，使用最广泛的果胶酶是Macerozyme(Macerase)，是从真菌Rhizopus中产生的。当只用果胶酶时，对叶外植体的细胞分离是有效的。一些报告阐明仅用果胶酶能从果实组织(即龙葵的浆果)释放原生质体。然而，在成熟过程中，这些果实组织能产生水解酶类。多数是把纤维素酶与果胶酶组合在一起，得到原生质体的一步游离法。已指出一种更强果胶酶Y23作为一种可选择的酶，当它与Cellulysin组合在一起时，在25min内可释放出烟草叶原生质体。Pectolyase是高活力的果胶酶和多聚半乳糖酶。
其他一些酶也用于游离原生质体。在多数情况下，用这些酶与表3-1中的酶类组合在一起并用来处理组织，易于释放出原生质体。例如从Snails产生的Helicase同Macerase和纤维素酶结合在一起用，能从马铃薯块茎释放出原生质体，Cononase是较强的果胶酶，当它与Cellulysin结合在一起用能从水稻愈伤组织释放出原生质体。Glusulase常用于生产酵母原生质体，它与Cellulysin一起使用，能释放出大麦糊粉层原生质体。Zymolase是从Arthrobacter luteus制取的一种粗酶制剂，它具有有效的释放花粉四分体原体质体。这些常用的酶对释放叶肉或细胞悬浮物原生质体通常是不需要的。
多数商品酶制剂含有毒性物质和不必要杂质。多数情况下，这些杂质包括了核糖核酸酶、蛋白酶、脂肪酶和各种各样的其他酶、酚类和盐类。杂质导致每批酶之间的不一致。这种不一致性是每批Driselase酶的一个特殊问题。Sehenk和Hildebrandt(1969)把商品酶提纯到只含有限毒性化合物，以提高原生质体的产量和活力。极高纯度的纤维素在释放原生质体上比部分纯化酶制剂的效应差，说明某些混杂酶对有效的细胞壁降解是必要的。当同未处理过商品酶制剂比较时，部分纯化的酶制剂改善了19种植物原生质体的产量和活力。另一些作者报告脱盐酶制剂改善了原生质体的产量和活力。表3-2总结了商品酶制剂脱盐的程序。脱盐在柱上进行最好。脱盐的酶促进原生质体分离，改善原生质体的活力和植板效率。中国科学院上海植物生理研究所从木霉菌制取的粗综合酶E368，其游离原生质体能力比纯化或专一酶较好。
表3-1 原生质体游离用的商业性的酶
表3-2 商品酶制剂脱盐程序
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