石刁柏
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第557页（14753字）
石刁柏(Asparagus officinalis L．)是与东地中海植被有关的欧洲-西伯利亚大陆植物。作为作物原产于远东和东部地中海基因中心。Cato报道石刁柏是罗马帝国的普遍的风味蔬菜。11世纪法国寺院首次列为蔬菜。法国和德国首先从事石刁柏育种。Henslow(1911)记载，直到17世纪古代居民更注重其药物性状，甚于用作蔬菜。提出原产地的石刁柏起源于栽培型，而后转变成野生型。
生长于温带气候地区，特点是早春土壤温度相对较高，亚热带条件下也有栽培。生长于沙土12-18℃。绿茎的比白茎或苍白茎的，对土壤类型选择不严。较老栽培品种是雌雄异株。雄性两性花同株系自交和花药培养结果，最近纯雄F1杂种曾引入栽培。
(一)育种和作物改良
石刁柏雌雄异株种，性比率为1：1，雄株花型有雄蕊花到雌雄同株。雌株是同型配子的(XX)，雄株是异型配子的(XY)，雄株可产生雌雄同株(XY)。具有雌雄同株特性的雄株是两性花同株，可异花或自花受精。用吉姆萨染色法，在三体后代中的三倍体石刁柏鉴别出一个性染色体。Y染色体的主要基因和常染色体的修饰基因决定着两性花同株个体的雌雄同株花表达程度。
石刁柏平均收获年代计10年。主要育种目标是：高产、高质量，特点是增加每株大直径幼芽数，幼芽一致，幼芽内纤维低水平，高抗病性，耐盐，气候适应性，就白幼芽言，要不变色。常规育种需时10年以上。Corriols-Thevenin(1979)提出双交杂交方法以缩短试验周期为5年。采用细胞培养技术，是营养繁殖的最实际方法。取幼芽顶尖分生组织培养外植体直接生根以完成无性系繁殖。
1．全雄F1杂种育种 石刁柏雄株产量较高。其培育方法(如图22-1)：(a)雄性两性花同株植株(♂)与雌雄同株花(♀)杂交，产生具有二个Y染色体的超雄植株。用超雄植株给雌株授粉，产生全雄F1杂种。雄性两性花植株占雄株的2%，有的育种材料可达10-20%。经鉴别超雄株的产量和品质的配合力后，可用细胞培养克隆亲本植株，短期内产生大量F1杂种种子。
图22-1 全雄F1杂种种子生产的超雄子代的培育方案
A．雄性两性花植株杂交产生全雄品种
B．测定区分细胞遗传不同雄株
2．石刁柏育种单倍体和纯合系 由于石刁柏是异交授粉植物，具有高度自然异质性。许多情况下，要求产生完全同质植株，方法是取得单倍体，继而加倍单倍体染色体。单倍体可由二种方式产生：选择多胚种子(0．23单倍体／1000种子)和花药培养。经秋水仙素处理后，取得可育同质雌株。产生同质植株的最有希望方法是，诱导花粉或花粉母细胞直接产生单倍体。
用异质雌、雄和超雄(YY)植株杂交后代进行的栽培品种比较试验，证实雄性F1杂种产量比老栽培品种和供试双杂交的为高。用经测试配合力的自交超雄基因型与不同雌株杂交产生的全雄F1杂种，可能得到高产。用经花药培养产生的二倍体纯系杂交取得全雄F1杂种平均芽重和其平均直径比较结果，同质F1杂种并非在所有情况下产量与品质都超过雌雄异株栽培品种。结果指出花药培养产生的纯合植株的后代间有更大差异。由此，花药培养产生超雄植株可能不是取得高产全雄F1杂种的前提；必须供测其配合力，和与异质或同质雌性基因型的自交系。原则上，植株的同质性对培育高产石刁柏栽培品种并无裨益。雌雄同株自花授粉创造着宽广遗传基础的F1杂种，可组成四种基因型组合的混合体，相当于双杂交杂种。Fiala与Jolivet(1979)解释雄株的较高芽生产量，证实了2-4年老株根内，积贮性专化的贮藏物。
(二)研究进展
石刁柏再生潜力低，常规分冠繁殖成功有限，改用在高温度下的钵栽石刁柏茎发育空气冠进行营养繁殖。细胞培养中，偶得空气冠，大都用抑制主茎或侧芽生长后，从外植体基部产生。由分取个体冠和诱导空气冠，不易产生遗传上一致植株。只有人工培养技术证明了是大量产生特殊选择的亲本植株或栽培品种的适宜方法。从茎尖取分生组织和芽尖，和大田生长的蕨或白石刁柏幼芽作外植体取得了完整植株。初步试验在无菌条件外建立插枝生根未获成功。依靠营养培养基成分，外植体器官发育成芽，继之生根或产生不同时期脱分化的愈伤组织。
1．器官培养不经形成愈伤组织繁殖石刁柏 消毒后，从大田生长幼芽幼侧枝上切取茎尖(约长0．15mm)供无性繁殖。这种外植体含有分生组织尖盖和少数叶原基。较大外植体生存频率较高，并较大倾向长成多幼芽和愈伤组织，而较小的形成完全再生植株。培养基成分如下：
无机组成： MS
有机组成：
NAA 0．3μM
KIN 0．49μM
盐酸硫胺素 2．96μM
盐酸吡哆醇 0．024mM
烟酸 0．04mM
肌醇 0．55mM
硫酸腺素·2H2O 0．15mM
甘蔗糖 0．07M
其它成分
Difco Bacto麦芽提取物 500mg／l
NaH2PO4·H2O 1．23mM
Difco Bacto琼脂 6．0g／l
若干学者采用上述方法取得同样结果。附加细胞分裂素和生长素浓度变动在0．3-1．4μMKIN和0．5-1．6μM NAA。矿质营养成分变化，尤其是KNO3较高1．66(与MS相比)，在加0．5μM NAA时，影响外植体分生组织生根。再者，各种大小茎和茎尖生根，用0．5μM NAA不加KIN继代中发生。不定芽旺势有赖于它们的年龄，从而影响生根能力。经4-8周生根期后，4和5月龄再生植株结果最好。自取外植体到再生植株移栽入土需时6-8个月，或12-14个月。离体培养建立原种母株后，培养其侧芽，可用于进一步营养繁殖。继代芽的繁殖率视茎旺势和芽位置而定；茎基部和中部产生更完整再生植株。茎尖培养形成植株最适温度为27℃。幼芽和根启动的最适光强为1000勒克斯，光周期16h，强达3000lx对茎和根启动可相等满足。茎尖基部类愈伤组织胀肿块内的不定启动成根，幼芽则是侧芽生长结果。
再生植株移植，提出在加蔗糖营养培养基培养的带根分生组织是异养的，不能形成冠部，不能适应园艺栽培条件。Haseyawa等(1973)认为形态缺陷也是移植失败原因。因为强光能促进幼芽上分化叶状枝，为此推荐用移栽前在强光10000lx下再结养，以取得较好效果。但是在3000lx，移栽植株的存活未看到显着降低。从试管内移栽后，立即用塑料膜盖上，保持相对低温下，相对湿度90%比70%的生存率较高。很小茎尖直接发育成完整再生植株，不经愈伤组织阶段，提供遗传稳定性。Hasegawa等(1973)报道细胞培养产生的植株染色体数与亲本相同。应用茎尖培养，取长0．1mm分生组织作外植体，可能消除病毒侵染(Yang，1979)。消除石刁柏病毒AV-1，可用0．1-0．3mm茎尖，但AV-2则应采用无叶原基的较小分生组织。
2．器官外植体启动愈伤组织培养物再生石刁柏植株 取茎尖作为插枝直接生根取得克隆繁殖成功。这种方法每插枝只能产生一株或用原初外植体基部分枝时，产生少数植株。繁殖率低曾与移栽入土后生存率低有相关。为了增高营养繁殖植株数，进行了形成愈伤组织和再生不定器官试验。用茎尖、幼芽尖和侧生分生组织，幼芽基部切段的髓组织，叶状枝的单细胞作为启动外植体，在基础培养基附加2，4-D和NAA配合不同细胞分裂素，诱导形成愈伤组织。愈伤组织培养体保持在固化和液体培养基中，用适当浓度荷尔蒙，促进器官建成。
高度液泡化愈伤组织细胞分化的第一步，是使它们转化成细胞质浓，类分生组织，或胚胎发生集团的细胞。采取失绿茎0．5厘米，培养在Galston-Loo培养基附加27．μM NAA。Gorter(1965)诱导基部有根启动的愈伤组织在加硼酸液体培养基中发育成再生植株。无菌幼苗下胚轴培养在LS加4．5μM 2，4-D和1．5μM KIN取得生长旺盛愈伤组织，经继代在成分相同的液体培养基中短时间内，其生长模式改变。多数浓密细胞集团发育成球形单元叫胚。降低2，4-D浓度，这些单元数增多。大小超过2mm，在悬浮体里这些胚再次脱分化。转移的再生植株中，发现有些是多倍体。无侧芽的幼芽切片在MS加2．7μM NAA和15%CW，培养4-6周内，在切盘基部形成愈伤组织。幼芽从远离芽尖处切取的切盘，愈伤组织生长比断近芽尖的为好。附加50mg／l ADE促进茎叶形成。尽管愈伤组织内看到倍数性变化，其再生的全部植株是二倍体。Malnassy和Ellison(1970)比较了根切枝繁殖的和愈伤组织培养体取得的石刁柏植株的倍数体水平。观察到来自愈伤组织培养体的植株，四倍体比根切枝的为多。
用NAA代替2，4-D，尤其与BA相配合时，有利于髓外植体产生的愈伤组织再生根和茎叶。BA和NAA最适用量为0．1-1．0mg／l，其中之一增加到10mg／l，降低再生植株产量。Hanault(1975)报道基础培养基对愈伤组织增殖的明显影响。例如，LS加硫胺素、硝酸盐和铵离子与其它六种基础培养基相比，效果最好。Harada(1973)描述了不同类型的生长素和细胞分裂素和水解酪蛋白，对培养在MS上的石刁柏茎外植体的形态建成反应的效果，如形成愈伤组织，根，茎叶，和体细胞胚。0．5-5．4μM NAA促进愈伤组织生长效果比2，4-D好，而ZEA，BA和KIN活性相等。5．4μM NAA比2，4-D对产生不定根为好；对生根的抑制效果，以0．05μM KIN最强，BA中等，ZEA最弱。NAA 0．5μM加ZEA 4．6μM有利于愈伤组织再生茎叶，而BA和KIN效果较差；水解酪蛋只能刺激茎叶发育。
光培在2，4-D上的茎切段启动诱导愈伤组织期间进行组织学研究，指出愈伤组织起源于亚表皮的分散的形成层，具有许多假导管。愈伤组织培养体的进一步发育，从其表面形成许多根，但根形态发育不全。2，4-D和有时NAA造成的不定根反常结构，导致离体培养再生植株移栽后大量死亡。这些发育不全根在土中退化，不能保持其吸收水分和营养能力。
为了改进愈伤组织培养体的繁殖率和提供无形态偏差和功能失常的不定器官分化，繁殖程序可分二个不同阶段。白和绿色幼芽的离体茎尖和侧枝尖，培养在LS附加5．4μM NAA和4．6-9．3μM KIN固化培养基上，继代后启动增殖阶段(LS+5．4μM NAA+4．6μM KIN，外植体基部接触培养基处诱导产生愈伤组织，茎尖横向增大，纵向伸长被抑制)。愈伤组织形成后和增殖(品种Schwetzinger Meistarscheuss的第二次继代在LS+5．4μM NAA+4．6μM KIN；高度分化的增殖中愈伤组织)，可把愈伤组织块转移到相同基础培养基加5．7μM IAA和0．4-4．4μM BA或0．5-4．9μM 2iP。大多数先产生茎叶(超雄发生者愈伤组织阶段的离体冠，培养在LS+5．7μM IAA+0．98μM 2iP)，或促进茎叶和根形成(超雄基因型的器官建成愈伤组织具有茎叶、冠启动，根；培养在LS+5．7μM IAA+0．44μM BA)，但未看到形成根。茎叶愈伤组织在LS+2．9μM IAA很快生根(将茎叶转移到LS+2．9μM IAA8周，形成冠，伸长中的茎叶和根)。用IAA代替NAA，愈伤组织高度生根倾向下降，并分化成茎叶。茎叶和根基部上的冠结构与幼苗很相似，再生植株在温室内继续生长，无一死亡。
3．离体单细胞和原生质体产生的愈伤组织培养体的发育 从叶状体机械地分开叶肉细胞，植板在改进的MS+寡原素(oligoelements)，NAA和BA上。生存和有丝分裂活动有赖于细胞密度。高密度植板(3．5×105细胞／ml)有丝分裂可达生活细胞的40%，发育成小克隆，每个有约10个细胞。细胞密度降低到5×104细胞／毫升，分裂的细胞下降到5%，但余下的克隆增大。加NAA，BA或IEA可能促进来源于单细胞的愈伤组织增殖。当基础培养基中不加矿质氮NO3-和NH4+，代之以谷酰胺(30mM)，生存率较高，细胞群体的有丝分裂活动增高。这种现象与石刁柏叶状体(无硝酸还原酶)的特殊氮代谢有关。
Bui Dang Ha(1973)报道了叶状体叶肉细胞原生质体产生的愈伤组织里的器官建成。以原生质体浓度3-5×105／毫升植板在液体培养基中，开始形成完全未分化愈伤组织，继而将直径1mm克隆转移到固体MS+Nitsch的微量元素和维生素。加NAA，BA或ZEA促进愈伤组织增殖。ZEA和2，4-D存在时，未看到茎叶启动。IAA(0．5-2．5μM)十BA)4μM)的组合，刺激了愈伤组织的再生能力愈伤组织培养在不加生长调节剂(如继代阶段)的基础培养基上，从加ADE(300μM)，NAA和BA培养基转移后，产生球形和香蕉形单元，叫体细胞胚。
4．石刁柏花药培养离体培养雄核发育 从不同成熟时期石刁柏花芽取得花药，接种在MS大元素，Heller微量元素不加FeCl3，0．1mM FeSO4·7H2O，0．11mM Na2EDTA，Morel的维生素B混合液0．058M蔗糖和5g琼脂。组织学研究指出，加0．5μM NAA，0．9-4．4μMBA和4．5μM2，4-D刺激了单倍体细胞增殖，至少产生一块雄核发育愈伤组织的花药频率4-10%，视基因型而异。花药愈伤组织再生植株倍数性水平为n，2n，3n，4n和6n。原来的单倍体愈伤组织中自发二倍体化结果，产生同质雄和雌株。雄核发育愈伤组织的深入细胞遗传研究看到核型高度不稳定性。2月后，平均倍数性水平为6n。在相同条件下，体细胞组织产生的愈伤组织的混倍体性程度较低。尽管雄核发育愈伤组织的混倍体性，不定芽是同倍体。一般言之，花药培养没有得到单倍体石刁柏植株。大都是从愈伤组织二倍体化的花粉产生的二倍体。这种结果可用雄株后代测交来证实；在一致的雄性F1杂种中，曾取得了授粉者的超雄特性。Falavigna(1979)观察到愈伤组织形成的差异与基因型有关。培养95基因型，只有7种产生愈伤组织频率大于3%。愈伤组织再生能力，也与特定花药供体有关。依据倍数性特点，可分二类不同愈伤组织。一是“偶倍体愈伤组织”，产生倍数性水平相同再生植株，尽管愈伤组织细胞的细胞学异质性；一是“混倍体”愈伤组织，产生倍数性水平不同再生植株。
当用单核期花粉的花药培养在MS加0．4μM BA和5．4μM NAA时，大都产生愈伤组织(79．3%)。另一方面，成熟期花药形成愈伤组织百分大为较低(3．9%)。这种系统产生的再生植株中，看到二倍体和四倍体染色体组成。二倍体花药壁、药隔组织和花丝切端培养在MS加各种浓度蔗糖和NAA中产生的愈伤组织发育，必需予以考虑。
石刁柏花药培养的成效，受遗传和环境因子的高度影响。Falavigne等(1982)测验将近98000培养的花药，供试材料是20异质基因型和9纯系，以测定花芽大小，花药供体植株的环境条件，低温处理时间和培养基改变对花药培养的影响。
总之，近10年来，应用组织培养技术，石刁柏营养繁殖进展显着。各种浓度NAA促进了茎尖插枝和带叶状体的分生组织外植体直接生根。细胞分裂素刺激启动的外植体茎叶生长。采用很小分生组织培养，消除病毒成功。再生植株移栽土中后，在高光强下和改变硝酸盐供给和园艺管理，生存率有所改进。从器官外植体建成具有高生殖潜热的中度生长中愈伤组织，为石刁柏再生植株的分化和很快繁殖提供着很合适系统。用IAA代替2，4-D和NAA，并与各种细胞分裂素相配合，结果使愈伤组织生长和根形成，以及冠形成。由此，形态学上条件再生植株，易于适应温室环境。若干论文描述了愈伤组织产生体细胞胚，通常基于它与合子胚形态相似性加以判别。在若干情况下，似有将茎叶或根片段解释成胚。
来源于单细胞和叶状体叶肉细胞的原生质体的愈伤组织再生石刁柏植株是一个重要发展。这种方法有助于将来诱导体细胞突变和筛选抗病性或作物改进的其它因子的发展。考虑到石刁柏育种周期长(10年以上)，和难于取得超雄自交系，用花药培养产生同质超雄和超雌植株，将能缩短取得雄性F1杂种的育种程序。但石刁柏愈伤组织特别是花药愈伤组织的遗传高度不稳定性，仍是问题。
(三)培养程序
1．无性繁殖技术 石刁柏无性繁殖有二种途径：(1)直接一步器官建成或(2)愈伤组织间接再生植株。从原初外植体如花药、单细胞和原生质体诱导器官发育，第一阶段是愈伤组织形成。体细胞器官外植体，在分化不定芽前，也易产生愈伤组织。另一方面，愈伤组织增殖和分化，是取得高繁殖率的很相宜材料。可是，这种方法需要从不同基因型取得的愈伤组织类型的再生趋向，能在培养中长期保持。
在脱分化、增殖和组织化过程中，器官外植体愈伤组织形态和组织学状态，以及每个阶段的培养基，如Reuter(1977，1978，1979)和未发表资料(表22-7)所述。阶段1和2是增殖阶段，阶段3是器官建成。愈伤组织形成应采用附加NAA和KIN培养基，这样可抑制生根。具有再生植株趋向强的愈伤组织系，在IAA-BA培养基上，可保持5年。在IAA-BA培养基上的愈伤组织增殖能力低或中等的，可能产生生长率逐步降低结果。因此，将随时把愈伤组织转移到NAA-KIN培养基上，以诱导其增殖。基于愈伤组织培养体的基因型来源不同，在NAA-KIN培养基上多次继代(10次以上)，可能降低再生潜势。可是，在NAA-KIN愈伤组织增殖培养基上，基因型保持多少恒定器官建成特性。雌和雄株初级外植体愈伤组织形成趋势最高，超雄株最低。栽培品种间器官建成(例如：茎叶启动)对BA或2ip的要求有所差异。
表22-7 石刁柏愈伤组织培养物和不定器官发生
(Reuther，1978，1979)
a．Linsmier-Skoog(1965)，改用高浓度KH2PO4(1．84mM)和KNO3(24．7mM)。
增殖中愈伤组织的组织学研究指出，愈伤组织细胞是圆形，高度液泡化，细胞质膜极薄，沿着细胞壁，细胞间隙宽大，无储藏代谢产物(增殖中愈伤组织的高度液泡化细胞；改进的LS+5．4μM NAA+4．6μM KIN)。愈伤组织细胞转化成具有器官建成潜力的细胞，首先在细胞质里出现蛋白质合成，继而分泌到液泡中去(在LS+5．7μM IAA+0．44μM BA的增殖中愈伤组织的发育，细胞内细胞质含量增加，细胞质里的蛋白质微滴，经液泡膜进入液泡，有些细胞在类分生组织细胞中心区域沉积淀粉，形成原维管束鞘)。这些颗粒移入液泡中央，融合成较大，形状不规则的蛋白质体。在器官形成过程中，蛋白质微滴被代谢了。代谢作用与继后有丝分裂活动相关联(不规则形状的蛋白质，表示分解的不同时期，同时细胞质增大)。下一阶段的器官建成出现原形成层原基分布不规则，和在愈伤组织表面上出现茎叶芽(由增大的叶状体形成的茎叶原基包埋在一个腔内)。有可能石刁柏愈伤组织内储藏组织的这种分化模式，是器官发育的前提。
曾鉴别出二种茎叶的不同组织类型(图22-2)。来源于愈伤组织表面层，这些芽包含着顶尖分生组织，在包埋顶尖的鳞片轴内的叶状体原基，在愈伤组织内层里与假导管节松散连接的原形成层股段(图22-2a)。一般言之，这些芽生长很快，光下转绿，在基部常发育成具有有限生长能力的白色冠原基(图22-2b)。组织学上看，这些圆筒形白色单元，包含一个茎叶芽，包埋在由长组织被膜形成的穴内(图22-2d)。过去错误地把这些组织是胚(由于它们的形状和大小与体细胞胚相似)。体细胞胚胎发生特征是分隔成多细胞、球形、原胚胎发生细胞复合体，围以原表皮层。原胚伸长成双极结构，茎叶与根极，其间多少为愈伤组织隔开。与其它单子叶植物如鸢尾的体细胞胚胎发生相比较，石刁柏胚与合子胚的结构不同。
图22-2 石刁柏愈伤组织产生不定器官的分化模式示意图
a．茎尖外植体(AE)启动的初级培养体，示出茎叶，冠原基和愈伤组织b．愈伤组织分化类分生组织单元(C)c．愈伤组织里的原胚状体(PEM)d．原胚状体中期阶段e．胚状体(EM)最后阶段f．茎叶芽原基g．包埋在过度肥大的叶状体的茎叶芽原基叫冠原基
经配合力测试的自交超雄基因型的大量后代(品种Lucullus的授粉亲本)和雌亲植株都用组织培养营养繁殖。取温室植株根尖涂沫法制片观察染色体数倍性水平无改变，虽然反常增大愈伤组织细胞可能是高度多倍体性。愈伤组织培养取得的遗传相同超雄和超雌克隆，以及直接从带根的茎尖外植体繁殖的植株，比原来YY自交系和雌株后代相比较。原来自交系和50愈伤组织产生的和茎尖繁殖的超雄植株，50雌株授粉，种子生产率和子代的繁育元可测出的差异。大田愈伤组织产生植株生长旺势有所加强，表现出大量茎叶和生长率明显较高。
2．花药培养产生的纯合石刁柏系 讨论了同质超雄和超雌后代在培育全雄F1杂种栽培品种的重要性。雄核发育成功受下列因素的明显影响，不仅是培养基的适宜成分，还有外植体花药的发育时期和供体植株的环境条件。Falavigna等(1982)认为在下列条件下，愈伤组织形成出现最大雄核发育潜势：(1)花芽长度(单核小孢子)1．6-2．1mm，(2)7℃花芽低温予处理10天(视基因型而定)，(3)固体培养基(在液体培养基中只有半数花药发生反应)，(4)0．12mM蔗糖，和(5)夏季室外植株取的花药比温室植株为好。
98000个花药中，只有2-3%形成愈伤组织。花药愈伤组织培养用培养基成分是：MS大元素，稀释2倍；Heller(1953)微量元素不加FeCl3；Morel和Wetmore(1951)维生素；0．1mM FeSO4·7H2O；0．11mM Na2EDTA；0．058mM蔗糖(0．12M)；6g／1琼脂，pH5．8；和2．2μM BA，2．3μM 2，4-D和0．5 μM NAA。
小花药产生的愈伤组织经4-6周后，应转移到相同培养基附加1．3μMBA。取茎愈伤组织切成带芽小块，供进一步繁殖和生根。供插枝长成再生植株用的继代培养基，是或无荷尔蒙，或加5．4μM NAA，0．5μM KIN和0．3μM GA(Dor′e，1975)。
3．离体单细胞的培养物 采用Jullien(1973)和Jullien等(1979)的培养方法。取叶状体用机械法分离叶肉细胞，从温室生长30-40天龄幼芽开花后一周切取。叶状体经7%次氯酸钙表面消毒20分钟，洗，放入30ml 0．12M蔗糖溶液磨碎。用蔗糖溶液洗3次后，将细胞悬浮体稀释到50ml，约含5×106细胞／m1。
建议用由MS大元素，Nitsch(1969)微量元素，和Nitsch和Nitsch(1965)有机成分组成的液体培养基。无机氮化合物用30mM谷酰胺代替，K用KCl；加NAA(5μM)和BA(0．5μM)。全部培养基用微孔过滤器过滤消毒最后接种密度是2×105／ml，加入25ml液体培养基，装在250ml欧氏三角瓶内，振荡100rpm，连续日光荧光(6000erg cm-2s-1)，26±1℃。离体细胞的较高生存率和提早进入有丝分裂活动，谷酰胺极其重要。叶状体年龄影响着生活细胞产量，和细胞培养体的进一步发育。
(四)展望
石刁柏愈伤组织遗传不稳定性，即混倍体性，主要存在于花药产生的愈伤组织中，但体细胞外植体也看到。遗传稳定性是经测验配合力的克隆后代和选自各种栽培品种高产基因型集团繁殖的前提。已证实了愈伤组织类型，在许多继代阶段中，保持高再生潜力，一个样本在一个试管中可产生若干茎叶和几个冠原基。与来源基因型相比，倍数性改变与培养基中的2，4-D和NAA有关。研究IAA和其它吲哚衍生物与细胞分裂素相配合，以求在愈伤组织细胞中较高遗传稳定性，可能是有价值的。探索经许多次继代后遗传稳定性如何改变，和鉴定稳定花药愈伤组织的条件，有重要性。大量报道证实着从混倍体愈伤组织再生二倍体植株，由此整倍体细胞的再生能力，可能比非整倍体细胞为高。全雄F1杂种栽培品种是石刁柏栽培的最合需要的品种。超雄植株自交后代已证明了产量的优越性。花药培养直接再生单倍体石刁柏植株很少见，因此，再生二倍体的同质性必须经测交证实。要进一步探索再生植株的直接雄核发育以改进培养的花药的再生频率。
为了突变育种方案，愈伤组织的遗传不稳定性，可供选择高产或抗病基因型。应将愈伤组织和人工培养再生植株继续暴露在病原菌过滤物中，以选择抗性基因型。从离体叶肉单细胞和原生质体产生器官建成愈伤组织，也能鼓励建立石刁柏突变育种。
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