葱蒜类
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第515页（20305字）
葱葫属归百合科，北温带有900种以上。栽培葱葫种来自近东和中或东亚，x=8。洋葱(Allium cepaL．)和大蒜(Allium sativum L．)二倍体2n=16，只有栽培种。青葱(Allium porrum L．)是三果葱(A．ampelloprasum)的栽培种，四倍体2n=32。
(一)研究进展
葱葫属染色体数少、形态清晰而长，特别适于研究组织培养中的核型稳定性，也能研究再生株核型变化。葱葫属离体培养成果列如表1。
1．分生组织培养 分生组织培养基于培养分生组织顶盖和邻近或多或少分化组织(叶原基)，视外植体大小而定。一般用于消除病毒和微繁殖，它能保持遗传稳定性，用于离体培养种质保存(深冻保存)。
(1)洋葱 Hussey(1978)取洋葱鳞茎主芽长10-15mm带有1mm平面组织，培养在MS加BA(2．2-17．8μM)表面上，4-6周后产生多分枝再生植株。这种再生株培养在加BA(4．4-17．8μM)和2ip(4．9-19．7μM)加NAA(0．6-2．7μM)培养基时，产生3-5腋芽，在肿大的叶基格外长出10-20不定芽。Hussey(1978)提出不定芽的遗传稳定性界于腋芽与愈伤组织再生植株之间。Novak等用2-3叶期洋葱植株切取茎尖，大小约0．5mm。培养在BDS培养基上，研究单用BA和NAA(浓度0，0．1，1．0，5．0和10．0μM)或配合，未见芽增殖，只有单个芽，有时带根。生根植株染色体数是二倍体。长期培养(14周)观察到有些外植体的芽的增殖，是从愈伤组织再生的不定芽结果。与Hussey结果相反，Novak等未能发现洋葱增殖，可能由于内生植物荷尔蒙水平不同，加之外植体大小不同，或由于供试基因型不同。
(2)大蒜 Messiaen等(1970)取气鳞茎上的充分发育的分生组织人工培养取得再生植株。Havranck(1972)从幼株取0．4-0．6mm外植体，培养在MS加NAA(5．4uM)形成了芽。发现肌醇和水解酪蛋白对再生芽频率有正效应。在同样培养基上芽生了根，但以无荷尔蒙时为好。植株基部的小鳞茎干后种于土中长成植株。这样，87%植株无大蒜嵌镶病毒(GMV)。大于0．6mm外植体生长较好，产生少数无病毒再生株。<0．4mm未能成活。另一方面，Aguso等(1980)从0．1-0．15mm外植体取得再生株。
如果人工培养技术与热处理相配合，可用较大外植体，而无降低无病毒植株的危险。根据上述条件，似有可能用1-2mm外植体取得无病毒植株。Bhojwani(1980)取长5-8mm茎芽，以研究植株增殖所需条件。看到芽增殖主要受2ip(2．5μM)与NAA(0．5μM)影响，培养基类型也有关系。B5比MS每个培养体平均芽数多二倍，可见基础培养基本身可能是再生强度的重要因素。
Novak用0．5mm外植体培养在BDS加NAA和BA(0，0．1，1．0，5．0，和10．0uM)或配合，培养4周后出现芽增殖。其频率视培养基不同和外植体对供试荷尔蒙组成分应而有异。在无荷尔蒙培养基上也有增殖，但芽小。加细胞分裂素和生长素培养基上产生一个以上芽。各种生长调节剂组合对植株繁殖影响，用腋芽指数表示(外植体数×繁殖程度)。由此发现1μM NAA和5μMBA最好。植株是二倍体。
Novak(1983)培养大蒜分生组织产生四倍体。分生组织用秋水仙素(3000mg／l)处理：(1)切离后立即处理，或(2)培养一周后处理。前者外植体培养在固化培养基上，加细胞分裂素；后者秋水仙素加入液体振荡培养体中2天。二者中加4%二甲基磺砜结果都有所改进。在140再生株中，22．9%是纯四倍体，15%是细胞嵌合体，根分生组织中有二倍体和四倍体细胞。
2．胚培养 Guha与Johri(1966)发现离体洋葱胚最适生长培养基是Nitsch(1957)基础培养基加24μM色氨酸。加IAA无正效应。Dolezel等(1980)把异种正反交杂种(洋葱×葱)胚培养。其生长比洋葱培养体为差，但取得再生植株，移栽后生长到成熟。B5最适于洋葱的离体胚。暗培下植株增殖数明显降低。胚培养再生株数比种子繁殖较多。也曾用于研究发芽的生理问题。
3．器官片段培养 植物器官培养在不脱分化情况下能诱导芽形成。有时离体器官或其部分上发育成芽，继而形成愈伤组织和次生再生芽。这关连着葱葫属的离体花穗和基板(真茎)的培养。由于愈伤组织培养再生株发生遗传变异，这种事实对克隆繁殖很重要。
(1)洋葱 葱葫属有许多种在花序上形成气鳞茎-营养繁殖体。有些种完全失去生殖能力。人为条件下即使一般不形成气鳞茎的也能诱导产生。洋葱用种子繁殖，但除去花后，花序上有气鳞茎发育。用生长调节剂或水处理花序，可促进其形成。Dunstan等(1977，1979)培养离体花穗诱导植株再生成功。
芽再生成功受许多因子影响。首先是取外植体时供体植株发育年龄。前减数分裂期的植株再生株数最多。另一因子是基础培养基。以BDS，加各种水平和类型的生长物质。虽能在无荷尔蒙培养基再生芽，但比加荷尔蒙的数量较少。BA(0．4-44μM)+2ip(1μM)+NAA(0．5-5μM)+IAA(0．6μM)再生增高。单用2，4-D(0．3μM)、IAA(0．6μM)或NAA(5μM)有促进效果。
一个离体花穗平均产生98芽，即使培养基相同，各个外植体互有不同。Havel(1982)指出同一自交系的不同植株间有显着差异。再生芽数也受供体基因型影响。可将花穗纵切接种，外植体变小并不影响每花穗芽数。
再生芽来源确定发育植株遗传稳定性。这些再生芽是从部分分化结构或不经形成愈伤组织产生的。再生植株来源于多细胞，终而降低自发突变的不利影响。以后，离体外植体可能产生愈伤组织，形成次生再生芽。由此易于发生基因型改变。
洋葱离体基板或其部分上产生芽再生。Hussey等(1980)用“双生鳞片”基部与一小片基板组织相连，再生植株成功。
芽再生有赖于培养基中加细胞分裂素。生长素(NAA)对细胞分裂素有修饰作用。Hussey等(1980)提出NAA有抑制作用，NAA水平需经试验确定。
培养的外植体组织学观察指出，从邻近鳞片组织的基板组织直接(不经愈伤组织)诱导产生不定芽(Fujieda等，1979)。再生芽细胞学观察结果，确证有高遗传稳定性和二倍体染色体数。
(2)大蒜 Novak等(1982)进行大蒜离体花穗人工培养试验。用BDS不加生长调节剂取得再生。但单用BA(10-80μM)或与NAA(5μM)配合，芽形成有所促进。长期培养期间(约15周)，经把外植体转移到较低或不加BA浓度培养基后，芽形成显着改进。由此有可能用较高细胞分裂素“保存”外植体，需要时取得再生植株，为二倍体。
离体基板培养在BDS加BA(10-80μM)单用或与NAA(5μM)配合，在其基部先生根，培养3-4周后，顶部生芽。供试培养基上均能生芽，BA(10-20μM)单用或与NAA(5μM)配合芽数最多。结果指出大蒜基板培养比洋葱的能产生更多的芽，尽管生长调节剂浓度相等。BDS加NAA 0．1μM和KIN 0．1μM液培加纸芯诱芽生根。再生株为二倍体。
(3)韭葱青葱花穗培养在BDS+BA(10-80μM)单用或与NAA(5μM)配合，以加20和40μMBA的再生芽最多。加NAA促进芽再生。培养的花穗可保持再生能力达一年。继代间隔期可长达5个月。转移到新鲜培养基后很快发生再生，继之形成愈伤组织。Stan-daert和Metsenaere(1976)从基板切取同圆3mm立方体，培养在MS+49．3μM IBA和0．4μM BA，培养初期形成若干愈伤组织，2月后，在外植体上形成球形结构。2月后，这些结构可辨认为小鳞茎，每个外植体3个，取得100%反应。
Dunstan等(1979)用BDS加2ip(30-39μM)和NAA(5．4-10．8μM)有利于再生。指出在最适荷尔蒙范围内，任何培养基的重复培养瓶中有差异，因此无一可称最适的培养基。与芽的发育，同时存在愈伤组织。暗培中愈伤组织增殖旺盛，以致再生芽发生畸形。
4．愈伤组织培养物
(1)洋葱 Fridborg(1971)培养洋葱品种Proliferum气鳞茎培养的愈伤组织，其形紧密和结实，黄色，再生叶或再生根的邻近部分形成叶绿素。转入MS加IAA(5μM)NAA(5-50μM)2ip(2．5-25μM)甚至加2，4-D(5μM)后随即形成健旺器官，但继代2-3次后，器官建成为2，4-D所抑制。在最初6-8月期间，细胞分裂素似对芽形成有正效应。
Davey等(1974)深入研究洋葱根产生的愈伤组织生长和结构。根在加2，4-D(11．3μM)，IAA(11．4μM)和KIN(0．9μM)的培养基上生长良好。在不加生长物质基础培养基发育。NAA(5．4-13．4μM)和或不加KIN(0．9μM)促进愈伤组织生长和根启动。每克鲜重组织产生约400根原基。任何处理均未见芽形成，而论是暗培或光培。
反之，Freeman等(1974)报道Mackenzie等从基板产生的愈伤组织上观察到根和芽分化，虽其频率低。愈伤组织培养在B5+2，4-D(4．5μM)。
Selby与Collin(1976)用三个洋葱栽培品种幼苗根启动愈伤组织。其产生的无性系在生长、易碎性、黏滑性、色素互有不同。有些能发育成稳定特性，各系各有广泛差异。愈伤组织启动后立即出现，并能保持至少到第九或十次继代。Dunstan等(1977，1978)研究洋葱愈伤组织形成以BDS培养基最好。
洋葱蒴柄和幼苗胚根产生的愈伤组织形成了芽。蒴柄反应以培养基加2ip(9．9μM)和NAA(0．3μM)最适，幼苗胚根的愈伤组织表现广泛反应。发现在器官建成培养基上，只有已经在NAA和2，4-D启动的，才能生芽。生芽也有赖于愈伤组织年龄和接种后暗培。
有些2ip(11．1和9．9μM)与NAA(0．4和0．3μM)配合诱导体细胞胚发育。常与有生产力的愈伤组织中芽数多相关连。花穗培养中形成带有绿色区域的黄色愈伤组织。有时在愈伤组织诱导培养基(10-80μM BA，5μM NAA)发生再生。转入无荷尔蒙培养基后有所增多。Havel(1980)选出了继代18月后高度再生的培养体。
根据上述资料，可得出结论洋葱愈伤组织培养很易成功，但芽再生仍有困难。有赖于愈伤组织年龄和预培养历史，还有外植体组织和供体基因型。
(2)大蒜 Havranek和Novak(1973)首次建成大蒜愈伤组织培养体。用幼叶培养在MS+KIN(9．3μM)，IAA(11．4μM)和2，4-D(4．5μM)。在有IAA时，光对脱分化有负效应。2，4-D完全抑制愈伤组织的器官建成。当转入加KIN(46．5μM)和IAA(11．4μM)2周内开始形成芽。以后在分化的再生植株基部形成小鳞茎。
Kehr等(1976)从大蒜珠芽茎尖建成愈伤组织培养体。MS用于增加未分化组织，应加2，4-D，IAA和KIN。加CW也有效。IAA和KIN培养基上有芽分化。
Abo El-Nil(1977)从大蒜珠芽茎尖、鳞片叶盘和茎切段培养在MS+P氯苯氧乙酸(10μM)、2，4-D(2μM)和KIN(0．5μM)，愈伤组织进一步培养在改进的基础培养基加10μM KIN和10μM IAA。2，4-D是愈伤组织启动所必需。KIN和IAA不加2，4-D取得再生。植株易于移栽入土。第一世代(T1)常形成不分裂鳞茎。下一世纪植株行为正常。他是唯一报道愈伤组织培养体形成零散的胚的学者。
(3)韭葱(A．porrum) Debergh等(1976)研究基板培养产生愈伤组织，在MS加高于约25μM的IBA，NAA和IAA可能诱导产生。2，4-D无效。暗培一个时期后，可把愈伤组织转入无生长调节剂培养基，以取得芽和根。
Dunstan等(1979)培养韭葱基部也看到愈伤组织。带有邻近组织的愈伤组织继代，无论从暗培或光培带芽培养体取得的，接种在培养基上也能生芽。这种愈伤组织接种体由增殖中愈伤组织、芽原基和外植体材料混合组成。
Novak等(1981)培养花穗，其愈伤组织高度松脆，形态不同，表面上有白和绿部分，分界线鲜明。后者在加10-80μMBA单用或与5μM NAA配合产生芽愈伤组织可保持其再生能力一年以上。以后，芽形成停止，但愈伤组织仍能产生叶状结构。愈伤组织异型性与其组织学结构有关。在愈伤组织表面上形成的分生组织中心，逐渐生芽。
5．原生质体培养 Bracha等(1981)用洋葱，Opatrnay等(1977)用大蒜和韭葱分离原生质体，但未详细研究原生质体培养。Novak等从生长中大蒜植株最幼白色叶分离原生质体。用酶混合液：Onozuka R-10(2%)，Macerozyme(1%)和Driselase(1%)，溶于0．5M甘露糖醇溶液，加0．9%CaCl2·2H2O。培养4小时后，用接种培养液洗原生质体悬浮体3次，培养在改进BDS：BDS大和微量元素和维生素，58mM蔗糖，0．2M甘露糖醇，0．2M山梨醇，1g／l琼脂，10μM KIN，10μM IAA和5μM2，4-D。显微镜观察指出大量有2-5核的原生质体，这可能是分离过程中或人工培养中同种融合结果发育而成。用同法可从成熟绿叶分离原生质体。
6．次生产物合成 Fridborg(1971)培养洋葱愈伤组织，发现其具有洋葱香料成分，尤其生根愈伤组织。分化培养体比部分分化的水平较高。但其含量与活体植株相比相当少。组织分析指出这是由于缺少前导物而不是蒜氨酸酶。选择产生高水平香料成分的愈伤组织克隆未得成功。有些学者研究培养基添加物质，由于愈伤组织压碎时产生洋葱气味。并比较研究代谢途径、酶系统和完整植株和组织培养体间的差异。
7．愈伤组织和再生植株遗传不稳定性 葱葫属组织培养物是遗传不稳定的，与大多数其它植物种相似。研究体细胞克隆变异已成为主要目标，由了解其致因和机制，有利于选择这类培养程序，获得最高变异率或遗传稳定性的结果。它适于研究核型变异，由于其染色体数少和长。同时有可能取得保持高再生能力的长期培养体，供在组织培养全过程中深入研究核型变化，即在启动外植体、脱分化，短期或长期培养，再生，再生植株周期中。
现在知道葱葫属是体细胞多倍性种，在其组织分化产生特有的内生多倍体化。应牢记启动外植体含有多倍体细胞，在理论上，至少会参予核型异质群体的发育。
大蒜叶基片断(2n=16)不仅有二倍体细胞，也有内生多倍体，核DNA含量高达8℃：是用吸收细胞分光光度计，分析福尔根染色制品。详细方法见原生克隆。把叶基切段培养在只加2，4-D培养基上，产生强烈内生多倍体化愈伤组织。30天后初次培养体含70%多倍体细胞，大都四倍体，核DNA含量为4℃到8℃，少数达64℃。非整倍体细胞频率较低。诱导愈伤组织期间，能看到许多核变化，尤其内生多倍体核分段，和有丝分裂畸形，由于有丝分裂纺锤体扰乱，最常见是再组有丝分裂。启动的外植体原有内生多倍体，很少分裂。
大蒜初生愈伤组织培养物，有丝分裂活动很高，有丝分裂指数(M．I．)近7%。随着培养体年龄增大，M．I．下降，最后不超过3%。洋葱(2n=16)繁殖率，在长期培养体中比整体分生组织的显着较低。有丝分裂周期为36-120小时，平均68小时，而整体分生组织中平均周期为13．5小时。同样，大蒜愈伤组织培养体细胞周期也显着增长。在长期培养期间，其核型异质性变得稳定，视启动外植体基因型，类型和培养基荷尔蒙成分而异。Allium cepa var．proliferum愈伤组织培养体也复如此。
大蒜长期培养体特征是产生多倍体和非整倍体细胞，染色体数自亚单倍体到超八倍体。四倍体明显较多，有些系占48%。突出状态是也产生有丝分裂畸形，例如再组有丝分裂，多极有丝分裂，滞后染色体、染色体桥，间期细胞中有微核，以多倍体细胞频率较高的系内这些畸形最多。
葱属其它种组织培养体内核型不稳定性也是典型的。Yamane(1975)报道洋葱愈伤组织培养物细胞染色体数8-72个，75%是超二倍体。同样，Roy(1980)发现以多倍体细胞占优势。反之，Roy在韭愈伤组织培养物中(2n=32)不见高于二倍体水平，大都是亚二倍体。Sekerka(1977)观察到洋葱愈伤组织培养体细胞是亚二倍体到超四倍体。Nandi等(1977)在var．Proliferum愈伤组织培养物中取得同样结果。此外，也观察到染色体结构改变。Nova′k(1981)在大蒜愈伤组织培养物中二倍体和四倍体细胞有染色体结构变异。Sekerka(1977)Alliumcepa愈伤组织培养物中二倍体细胞染色体长度和中心粒位置有异。
大蒜愈伤组织转入再生培养基后(无2，4-D)，发生较低倍数体水平细胞的逐步选择，尤以二倍体为甚；但未曾发生非整倍体和多倍体细胞的完全丢失。大蒜愈伤组织培养物再生二倍体外，还有四、非整和混倍体植株。
大蒜愈伤组织培养再生植株的各类染色体频率为：二倍体占55．4%(2n=16)，嵌合体31%一个根分生组织中有2n-4n。多倍体和／或非整倍体频率视在无2，4-D培养时间而异。很有可能大蒜愈伤组织培养物产生细胞嵌合植株与分化的芽分生组织的多细胞源有关。另一方面，秋水仙素处理后，从分生组织培养取得完全四倍体。
大蒜愈伤组织培养体再生植株与珠芽后代相比较，某些表型性状变异较大。如株高，叶数、叶位，鳞茎重和形状，鳞茎内叶数，鳞片色。全都在花序上生产气鳞茎，有时在母体上有未熟发芽的倾向。取克隆后代进行营养繁殖似有可能使表型和细胞学状态趋于稳定。
基于目前所知，设想大蒜愈伤组织在人工培养下生长期间就地产生的多倍体细胞，是再组有丝分裂结果。很少看到核内复制，核内有丝分裂从未见到。
再组有丝分裂后有丝分裂纺锤体扰乱和有丝分裂畸形的致因尚待阐明。培养基对此直接影响尚未获证实。染色体结构变化如易位、缺失、倒置、无着丝点的和着丝点的片段资料更少。植物染色体区分染色法难予采用。常只现少数带谱。吉姆萨C-带法应用于洋葱方法。
其它机制如体细胞交换、基因增多或减少，姊妹染色子体互换(SCE)或转座因素对遗传变异性也有影响。由SCE测验易于记录和很敏感，曾广泛应用于检测诱变剂。化学诱导SCE与突变间发现极好相符。作者建议研究植物细胞培养中SCE，有助于研究它们的遗传不稳定性。
根据作者初步试验，大蒜每个细胞的SCE频率比根尖分生组织的为高。正在进一步研究予以证实，并研究影响其愈伤组织培养体内SCE频率的因子。大蒜愈伤组织细胞SCE检测法见原生克隆节。至于有丝分裂畸形，培养基对体细胞突变的直接诱导作用尚待证实。
由此可见，体细胞克隆变异对葱葫属栽培种改良有重要作用，虽其来源和可能控制条件知之不多。
(二)培养程序
1．分生组织培养大蒜和洋葱
(1)大蒜气鳞茎或洋葱蒴柄用作启动外植体。
(2)第2-3叶期取茎尖。除去其余储藏组织，根和叶上部分。
(3)70%乙醇消毒5s，5%氯氨B30min，70%乙醇5s，无菌蒸馏水淋洗5次。
(4)切去叶基部和叶鞘，在基板直上切取；切离分生组织顶盖，带一个叶原基和部分基板组织，外植体大小约0．5mm。
(5)基部培养在BDS培养基加1μM NAA表面上。1或5μM BA促进多芽形成。2-3周内应发育成芽。
(6)取长30-40mm的芽，放在纸芯上，浸入生根培养基，如BDS+NAA和KIN各0．1μM。
(7)再生植株移植园土中，保持高湿度水平2周，以后移入正常条件。
这种程序只有大蒜产生多芽，洋葱则不能。当能较大外植株时，可观察到洋葱产生多芽。除来源于腋芽外，可能由不定芽产生。生长调节剂用量视供试基因型可以调整。
2．洋葱胚培养及其异种间杂种
(1)用70%乙醇淋洗未成熟子房，蒸馏水洗3次。
(2)5%氯氨溶液消毒20分钟，无菌水洗3次。
(3)授粉后21天切取未成熟圆筒形胚(0．5-0．8mm)。
(4)将胚接种在试管中，装5ml B5，pH5．8，每管一胚。
(5)暗培25℃7天，然后放在光下，1200lx，16h光周期，25℃。
(6)培养8周后，再生植株高约10cm，移栽珍珠岩，以后移入园土。
必须核查授粉后胚生长过程，胚适当大小是0．5-0．8mm，视供试材料和环境因子而定。
3．花序培养(洋葱、韭葱和大蒜)
(1)用包在叶鞘内的花序作启动材料。最大花的花粉母细胞在减数分裂前或减数分裂期中。
(2)取包在叶鞘中花序带叶柄顶部约1cm消毒。
(3)70%乙醇淋洗消毒5s，5%氯氨B30min，70%乙醇5s，无菌蒸馏水洗5次。
(4)除去叶鞘和发育的花和花粳，除去其余叶柄(花可保留在花序上)，将花序成半切或切成四份。
(5)把基部接种在BDS+BA40μM+NAA5μM，培养瓶中。
(6)培养后4-6周芽再生(A．cepa较迟)。
(7)从外植体上在芽基部切30-40mm的芽，放在生根培养基上，BDS+0．1μMNAA和0．1μMKIN。
(8)取根系发育好的芽移入园土中，在较高湿度水平下生长2周，然后移入正常条件。
4．基板培养(洋葱、大蒜和韭葱)
(1)休眠后的鳞茎用作启动材料。
(2)除去干鳞片，切取基板。
(3)70%乙醇消毒10min，6%次氯酸钠30min，无菌蒸馏水洗5次。
(4)在基板之上切除鳞茎储藏组织，再切基板，取整体或切分部分〔带有附着在盘(基部组织)上的内部鳞片基部〕培养。
(5)取其余基板组织接种在BDS+BA40μM表面上。
(6)3-4周后相继再生芽，有时在基部生根，与再生芽独立无关。
(7)从外植体组织分离出30-40mm芽，放在纸芯上，浸入生根培养基，BDS液基+NAA+KIN各0．1μM。
(8)再生植株移栽园土，保持高湿度水平2周，然后移入正常条件。
诱导或保持再生用的生长物质最适用量，视供试基因型和取样时供体植株生理状态可以调整。
5．愈伤组织培养(大蒜)和植株再生
(1)大蒜珠芽或气鳞茎休眠过后用作启动材料。
(2)取第二到三叶期植株样本作外植体，除去其余贮藏组织，根和叶上部。
(3)70%乙醇消毒5s，5%次氯酸钙5min，用无菌蒸馏水洗5次。
(4)取内部失绿叶横切段约5mm。
(5)把叶外植体松疏地接种在培养基表面上，即BDS+10μM K1N+10μM IAA+5μM2，4-D，暗培。
(6)把愈伤组织继代在上述同样培养基上。
(7)愈伤组织转到BDS+50μM KIN十10μM IAA诱导再生植株，光培，16h光周期，25℃，反复在无2，4-D培养基上继代，加培植株再生。
(8)取芽转到液体培养基加0．1μM KIN和0．1μM NAA。
(9)带根再生植株移栽园土，保持高湿度水平，2周，然后放入正常条件。
6．启动和保持长期愈伤组织培养(洋葱和韭)
(1)包在叶鞘内花序作启动材料，最大花的花药内花粉在减数分裂时期。
(2)70%乙醇消毒5s，5%氯氨B30min，70%乙醇5s，无菌蒸馏水洗5次。
(3)切取花序组织，接种在BDS+40μM BA+5μM NAA培养基表面上。
(4)培养约7周后相继形成愈伤组织。
(5)愈伤组织继代在BDS十40μM BA+5μM NAA。
(6)BDS+40μMBA零星发生再生，转入BA较低用量培养基后可有增加，单加NAA5μM或完全不加荷尔蒙。无荷尔蒙培养基上，再生芽生根。
(7)取30-40mm芽转入BDS液体培养基+0．1μM NAA和0．1μM KIN。
(8)生根芽移栽园土，保持高湿度水平2周，然后移入正常条件。
7．分离原生质体(大蒜)
(1)大蒜气鳞茎用作启动材料。
(2)取第3或4叶期内部失绿叶，除去其余气鳞茎、根和叶上部。
(3)70%乙醇消毒5s，5%氯氨B30min，70%乙醇5s，无菌蒸馏水洗5次。
(4)取最幼失绿叶，切成小片。
(5)把叶小片放入酶混合液：OnozukaR-10(2%)，Macerozyme(1%)，Dri-selase(1%)溶于0．5M甘露糖醇溶液，加0．9%CaCl2·2H2O。
(6)暗培，26℃，4h，稍加振荡。
(7)用80μM网筛过筛。
(8)100×g离心8min收获原生质体沉积物。
(9)用0．5M甘露糖醇溶液加0．9%CaCl2·2H2O洗3次。
8．分离原生质体(洋葱)
(1)洋葱鳞茎用作启动材料。
(2)次氯酸钠消毒，有效氯13%，15min。
(3)分开鳞片，撕去内表皮。
(4)酶降解细胞组织和细胞壁。用纤维素酶(0．5%)和果胶酶(0．1%)，溶于0．7M甘露糖醇溶液，B5无机盐类，稍加抽气，使溶液更好渗入组织。
5)培养在27℃18h。
(6)用8层纱布过筛。
(7)60×g离心5min收获原生质体。
(8)用含0．25%CaCl2·2H2O和KCl和B5的0．8M甘露糖醇溶液洗3次。
9．福尔根染色
(1)最常用1．2-2．5mM秋水仙素水溶液预处理，25℃，3h。或用2．0mM8-羟二羧酸溶液。
(2)固定在无水或95%酒精和冰醋酸(3∶1)中，2-24h。固定后，材料可保持70%酒精中，放入冰箱备用。
(3)蒸馏水淋洗2次10min。
(4)5NHCl水解40min 20℃。
(5)蒸馏水淋洗。
(6)Schiff试剂染色lh。
(7)用新鲜SO2水洗3次10min(1g偏重硫酸盐溶于200ml蒸馏水和10ml1N HCl)。
(8)蒸馏水淋洗5min。
(9)45%醋酸浸1min使组织软化。如果需要可以延长。硬质材料应采用1%w／v果胶酶溶于0．1M柠檬酸缓冲液pH4．7 37℃，30-120min，使之软化。
(10)用解剖针除去根尖分生组织区域或染色过深的愈伤组织，放在载玻片上，加入滴45%醋酸，用盖玻片压片。压片前用解剖针轻叩盖玻片，助其分散。
(11)把载玻片放在冰块上。当制品结冻时，用刀片或解剖刀除去盖玻片。把载玻片浸入95%乙醇，换2次，移入无水乙醇，20min。一滴Euparal或Permount，用清洁盖玻片封片。
注：如制品用于细胞分光光度计评价核DNA，取消程序中的步骤1。
为了估计有丝分裂指数(MI)或记载后期，取消步骤1。也可取消步骤7，步骤4缩短到20min，步骤630min。
临时制片可用一滴果糖汁压片，但不适用于细胞分光光度计DNA测定．
10．吉姆萨(Giemsa)C带，根尖染色体(洋葱)
(1)用2．5mM秋水仙素水溶液处理根尖，25℃，3h。
(2)固定在无水或95%乙醇和冰醋酸(3∶1)中，5℃，24h。
(3)用0．1M柠檬酸缓冲液洗，pH4．7，换2次，每次30min。
(4)放1%w／v果胶酶溶于0．1M柠檬酸缓冲液中软化，pH4．7，37℃，120分钟，转移到0．25%w／vCellulase溶于同样缓冲液中，软化15min。
(5)用0．1M柠檬酸缓冲液洗，pH4．7，10min。
(6)压片法见前节原生克隆。
(7)采用干冰法(如上节所述)除去盖玻片。
(8)干燥经乙醇处理的载玻片可在室温下贮存。
(9)将制片移入45%醋酸60℃培养15min，使之脱嘌呤。自来水充分洗。
(10)为了DNA变性，将制片放入饱和Ba(OH)2溶液，室温下处理10min，自来水充分洗。
(11)培养在2×SSC(0．3M NaCl+0．003M)柠檬酸三钠(pH7．0)60℃，90min，用0．067M柠檬酸缓冲液淋洗，pH6．7。
(12)用新制Giemsa染色液染色，用0．067M柠檬酸缓冲液稀释25倍，pH6．7。应用显微镜观察载玻片以肯定最适染色时间、蒸馏水(pH7．0)洗制片，气干。
(13)把干片浸入二甲苯，加一滴Euparal、Permount或De-Pex封片。
注：酶液中软化时间，视酶来源和材料类型而定。
步骤9、10、11因视供试材料确定最适时间。
11．愈伤组织细胞姊妹染色子体互换的染色(A．satrvum)
(1)把愈伤组织移在培养基上，加100μM BudR，0．01μM FudR和1 uM Urd。
(2)暗培25℃。每第三天把愈伤组织移入新鲜培养基加诸衍生物。
(3)培养192h后，通过二次S阶段，有足够细胞数掺入了BudR。此时用2．5mM秋水仙素水溶解予处理愈伤组织，25℃，4h。
(4)固定在无水或95%酒精和冰醋酸(3∶1)，5℃，25h。
(5)用0．1M柠檬酸缓冲液洗，pH4．7，换二次，每次30min。
(6)用1%pectinase溶于0．1M柠檬酸缓冲液软化，pH4．7，37℃，60min，然后移入0．25%cellulase溶于同样缓冲液，软化15min。
(7)用0．1M柠檬酸缓冲液洗，pH4．7，10min。
(8)压力法见上节。
(9)用干冰法除去盖玻片，法见上节。
(10)载玻片经乙醇处理后，可在室温下贮存。
(11)用Hoechst 33258处理载玻片室温下30min(Hoechst制法：取lmg荧光染料溶于lml乙醇，取0．2ml这种溶液加入100ml 0．5×SSC)。
(12)用0．5×SSC洗载玻片5min。
(13)加盖玻片。
(14)把载玻片暴露在日光荧光灯下，距离10-20cm的热板上，280-380光束辐射，37℃，75min。
(15)除去盖玻片，用0．5×SSC洗载玻片5min。
(16)在60℃，用1×SSC处理载玻片60min。
(17)在5℃，用1×SSC洗载玻片5min。
(18)用5NHCl处理载玻片，20℃，15min。
(19)用蒸馏水洗载玻片，换水二次。
(20)用0．067M柠檬酸缓冲液洗载玻片，pH6．7，5min。
(21)用3%Giemsa溶于0．067M柠檬酸缓冲液染色，pH6．7，15min，蒸馏水(pH7．0)淋洗载玻片，气干。
(22)把干片放入二甲苯，用一滴Euparal，Permount或De-Pex封片。
注：酶液中软化时间视酶来源和材料类型而定。
从步骤1到4处理的愈伤组织必需放在暗中。
(三)展望
作物遗传改良的理想离体培养体系应有如下特点：
1．茎尖应易于切取，应在分生组织培养体中诱导产生多芽。
2．应在器官片段培养物中建立不定芽形成。
3．分生组织和器官培养体再生植株的遗传一致性，在长期培养条件下得以保持。
4．易于建成愈伤组织、细胞悬浮和原生质体培养体。
5．应在所有组织和细胞培养体中能诱导产生器官建成和／或体细胞胚胎发生而得再生植株。
6．在再生植株中应能诱导发生高度体细胞克隆变异，作为新基因型之源。
7．易于控制植板单细胞和由单细胞再生芽或胚的程序。
8．应能从花药、花粉和子房培养诱导雄核发育和／或雌核发育取得单倍体。
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