莴苣
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第505页（14820字）
莴苣(Lactuca sativa)是寒季叶菜，分布栽培于全世界。不同地区作为轮栽作物选适期栽种。以取生叶为主，或取茎煮食。可用以代替烟草，和油料作物或催眠剂。莴苣属菊科菊苣族，最常见染色体数2n=16，18或34。有300个种，莴苣是其中之一的栽培种，2n=18。
(一)研究进展
莴苣已证明适合在各种培养基和生长调节剂下组织培养操作(表21-5)。Doerschug与Miller(1967)首次从某些组织和基因型的外植体取得再生芽。研究了IAA，KIN，ADE和某些矿质盐类对再生的效应。进行了不定芽形成的细胞学分析。从一个或少数表皮细胞形成芽，芽形成早于叶肉薄壁细胞的愈伤组织形成和表皮细胞向内增殖。只有在下层组织发育了管胞后才能芽分化。植板后4天可见分生组织中心，8-9天后，在扩展的子叶上可见芽，以叶边切口为多。再生是经形成不定芽发生而不是体细胞胚胎发生。1971年Roberts等首次发表以莴苣髓外植体中木质发生一系列论文。
表21-5 莴苣外植体再生研究综述
Sasaki(1975-1982)深入研究几种生长调节剂，培养基成分、光、温对芽形成影响。制订了系列转移的原生克隆，结果每下胚轴外植体产生6个芽，100%外植体生芽。下胚轴分化细胞学观察结果与子叶的相似。下胚轴细胞悬浮体也能再生芽。此项结果为其他学者用不同外植体广泛研究所证实。
Kadkade等(1977)报道了植物色素对子叶外植体芽再生的影响。红光低水平刺激愈伤组织生长和芽形成；为远红光所逆转。Koevary(1978)研究成熟莴苣头状花序各部分外植体芽形成受光和温的影响。IBA诱导芽生根。Alconero(1983)从广泛的栽培和野生莴苣属基因型叶外植体细胞悬浮物取得再生植株。全部5种供试基因型都诱导产生了芽和根，但只有butterhead变种和一种L．serriola材料观察了完整植株。Webb等(1984)观察在单加KIN培养基上的芽形成，为外植体年龄，生长调节剂和光周期对从子叶再生影响提供更多信息。
Binding等(1981)报道了莴苣原生质体分裂。Engler等(1982)从叶原生质体再生植株。Berry等(1982)从温室生长植株叶原生质体植板率低，无菌下生长的幼苗叶、子叶、根原生质体植板率高达20-30%。
Sibi(1976)从子叶外植体再生植株，首次分析了从培养中莴苣再生的植株。把它自交几代和杂交，以研究观察到的广泛变异的遗传基础。Engler(1983)研究原生质体再生植株的变异，试图选择无顶枯病和朽叶斑病抗性。
1．髓外植体的木质发生 Roberts等选择莴苣为研究各种生长调节剂对其薄壁细胞髓外植体的木质发生的典型体系。大都用1×4mm直径的切盘，暗培在MS25℃7天。当供给一种生长素和一种细胞分裂素时，三天内可见细胞分裂，24h后发生管胞分化。其发育程度和模式视生长调节剂量和类型而定。加IAA(28．5-57μM)和ZEA(4．56μM)或2，4-D(0．45μM)和ZEA(0．46μM)产生的管胞数最多，最低水平IAA(5．7μM)和KIN或ZEA(0．45μM)产生愈伤组织最多，但只有少数管胞。加形态素(chlorflurenol，1mg／l)抑制管胞形成。Wilson等(1982)研究10×5mm直径髓培养在加或不加蔗糖，IAA57μM和ZEA0．45μM。证实了组织比重力和极性对木质发生稍有影响。蔗糖或其代谢产物在髓10mm移动，但IAA和ZEA只对靠近处有效。88mM蔗糖对管胞形成似乎过浓。
蛋氨酸(MET；25-50μM)可能作为乙烯前导物刺激木质发生。乙烯生化合成的前导物：MET，SAM和ACC使乙烯生产增高，增高每外植体的管胞数，与对照相比。有些处理鲜重也有增加，由此每克鲜重的管胞数不同，有时下降。乙烯合成抑制剂AVG，Co(NO3)2和AgNO3降低每外植体管胞数，但由于鲜重减轻，可能还涉及其它因素。用乙烯抑制剂和前导物处理也能平行影响鲜重和木质发生。其基本作用尚待证实。
Babile等(1973)证实了KIN似乎经调节cAMP水平发生作用。细胞分裂素(cytokinesin I)I(自然发生的cAMP磷酸二酯酶抑制剂)和8-Br-cAMP(稳定的cAMP生物活性形式)能代替KIN，促进木质发生高度有效。其它种KIN诱导细胞分裂素I和保护cAMP。莴苣木质发生同样受同样增多cAMP和茶碱(cAMP磷酸二酯酶抑制剂)的诱导。低水平8-Br-cAMP大大刺激愈伤组织生长，但不形成管胞。高水平进一步刺激生长和管胞形成。乙烯与cAMP互作对木质发生影响尚待研究。
2．影响外植体再生的因子
(1)生长调节剂 影响芽再生的生长调节剂研究列如表21-4。Doerschug等(1967)用Miller培养基加IAA28．5μM和各种浓度KIN。当KIN 2．3μM时，多数外植体产生大量芽，不加KIN无芽形成。ADE可代替KIN但效果差。子叶培养在MS而不是Miller培养基，单用KIN 2．3μM诱导生芽。当同时存在IAA(28．5μM)时，芽至少增多3倍以上。BA适量范围较窄，但最适浓度(2．2μM)时更有效。加GA3芽形成减少而增长。Stuart等(1977)取得同样结果，得出结论GA3(15μM)刺激细胞伸长但对细胞分裂无直接影响。Koevary等(1978)用IAA 28．5μM和KIN 2．3μM从叶外植体诱导芽形成成功。作者用IAA(0．06-28．5μM)加KIN(4．6μM)或NAA(0．54-5．4μM)加BA(0．44-2．2μM)诱导子叶生芽，但对扩张叶无效。
Sasaki(1975，1979，1982)用两种培养基从失绿下胚轴诱导芽再生。先把外植体接种在2，4-D(0．45μM)和KIN(0．46μM)，然后转入培养基单加KIN(0．46μM)。启动培养基加IAA、IBA和NAA效果不如2，4-D(4．5μM)，即使浓度比2，4-D为高亦然。指出2，4-D效应转入转移培养基可能是重要的。启动培养基可用ZEA，2ip，BA代替KIN，细胞分裂素核苷效低。ADE(0．74μM)在启动和转移培养基中效果与KIN(0．46μM)相同。从启动转入转移培养基时间是关键。愈伤组织7天后转移，芽形成最多，如果5周后转移只稍有刺激效应。
Michelmore比较二种程序，带小芽的外植体转入含KIN(0．46μM)不加生长素，正常形态的再生植株比例增高；培养基的生长素诱导形成次生芽和畸形芽。诱导培养基含IAA加KIN比2，4-D加KIN芽生长较快。
Sasaki(1975)和Alconero(1983)从细胞悬浮体愈伤组织再生芽，Sasaki用下胚轴培养在White加2，4-D(0．045μM)和KIN(0．23μM)产生的细胞悬浮培养体。A1conera用叶液培于B5加NAA(5．4-10．8μM)加BA(2．2μM)的细胞悬浮培养体。二者在把悬浮体植板在含KIN(0．46μM)或BA(4．4一13．2μM)固化培养基上诱导芽的形成。这些结果证实了莴苣适于悬浮培养，并能再生大量芽。
不加生长调节剂间或产生根形成。当外植体或愈伤组织培养在单加生长素或高水平的生长素与细胞分裂素相比，结果根形成茂盛。根常在用以从愈伤组织诱导生芽的培养基上产生，但较迟数周。将再生植株转入IBA(4．9μM)培养基上诱导80%以上芽生根。Alconero(1983)培养再生植株在含NAA(5．4-10．8μM)诱导生根。IAA(5．7μM)从新鲜子叶外植体生根旺盛，但阻滞芽的发育，诱导愈伤组织生长而不生根。
(2)培养基 曾用5种不同培养基于莴苣外植体培养(表21-5)。都能不同程度地支持芽再生，当供给适当水平生长调节剂时。莴苣愈伤组织有转黄倾向，当处于逆景时，向培养基排出黄色素，尤以MS和SH培养基为甚。Sasaki(1979)比较White与MS，用作启动培养基二者相等有效，但转移培养基以MS维持生长较好，或由于White(与Miller相似)缺少某些微量元素。在缺铁培养基上不能形成芽。常规用较窄pH(5．5-6．0)，再生则可宽得多pH 4．0-7．0。启动培养基以5．5和6．5最适，以后培养以5．5最好。
培养基间最明显差异是相对和绝对NH4+和NO3-浓度。还原氮浓度和形式对紫苜蓿体细胞胚胎发生是关键；氨基酸最有促进作用。莴苣愈伤组织似有相似反应。Miller培养基不加NH4NO3时，保留KNO3，莴苣愈伤组织生长加强，但芽形成完全被抑制。关于无机氮源，无论启动和转移培养基以NH4NO3(10mM)最适。加酪蛋白氨基酸(启动培养基用0．2-8%；转移培养基用0．2%)产生最高再生率。SH培养茎(NH4+低与NO3-相比)比MS芽形成率较高。氮源对莴苣再生影响尚待进一步研究。
(3)光 若干学者研究了光对再生影响，但未同时考虑光周期、光强，和光谱组成(表21-6)。Kadkade等(1977)子叶外植体在荧光16h光周期下芽形成良好；暗培生芽极少。红光影响，暗培中每天加5分钟低光强红光或远红光14或35天。红光(660nm)比暗培芽数增多二倍，愈伤组织重增
倍。远红光(740nm)单用对芽数无影响，但愈伤组织重稍有下降。红光后给以远红光消除了红光的刺激效应。
Webb等(1984)每天以200lx荧光的0，12或24h光周期处理光培予叶外植体。光仅稍增高芽形成，光培比暗培芽较多2倍。12和24光周期间或500和2000lx间无差异。Alconero(1983)暗培或2500lx荧光每天16或24h下培养悬浮培养体产生的愈伤组织。光对再生植株发育有所促进。
Koevary等(1978)用9h光周期研究光强对叶外植体再生影响。高光强(18000lx)促进芽较早发育，而较低光强(800lx)启动根而无芽。暗培对照未设，但处理光谱不同。Sasaki(1979)暗培或连续光培下胚轴外植体，研究不同生长调剂对芽形成效果，几乎所有情况下，光培生芽比暗培为多。这些资料与其他学者研究结果相符，即光刺激芽形成。
后来光与温互作对芽形成的深入研究，光的影响似更复杂。一系列试验中，培养最初两周内(一周在启动培养基上，后一周在转移培养基上)暗培有利于芽形成率，其余时期为光培。这与Kadkade等(1977)的资料有矛盾。尚待深入研究。
(4)温 多数研究在23-27℃进行，莴苣培养表现良好。Koevary等(1978)发现培养25℃的再生植株生长很快，产生长根，有些开花。20℃时，节间不伸长，生长慢；由此选择22．5℃为最适温度。由于22．5℃时愈伤组织生长和分化慢，分化在25℃启动。Sasaki(1982)温度效应为不同光和培养基处理所干扰。15或20℃无芽形成，除非在启动培养基内把KIN从0．46增到2．3μM。最初三天用15或20℃培养启动外植体，然后至少3天经30℃处理，芽形成最多。证实了这种处理比25℃启动7天显着较好。转移培养基上以25℃为宜。
(5)外植体来源 表21-7指出曾用多种外植体源为试材。其反应似相似，但芽再生难易有明显组织专化差异。子叶产生很快和一致，再生也很快，为诸学者所向往。Webb等(1984)报道三种比较研究子叶年龄与再生潜势关系。在供试条件下，4日龄子叶是生根和芽最适材料。Doerschug等(1967)比较成熟穗上取的子叶，下胚轴，根和内部叶的再生。根只产生根或愈伤组织加根；很少有芽。子叶在有些处理中最易再生，100%外植体产生许多芽。下胚轴反应中等。叶比子叶再生较差，但不能与下胚轴进行直接比较。Koavary等(1978)从成熟穗取样。髓片段产生愈伤组织，但无芽。从扩展中内部穗叶边缘取外植体，比内部叶身，再生芽更为常见而快。作者用扩展的绿叶取外植体，只能慢慢地形成愈伤组织，再生率低，幼龄扩展叶的反应与子叶相似。
表21-6 莴苣外植体再生条件
表21-7 莴苣原生质体分高和培养程序比较
供体植株的生长条件对培养行为也有影响。当用无菌生长的组织，接种前进行表面消毒，常只能在切边上(受伤部位)再生愈伤组织。当从密封生长箱内无菌生长植株取外植体，最初在叶身边缘产生愈伤组织，继而在展及全部叶身。Satter(1984)发现再生的和生长箱生长的甘蓝植株的化学成分和外角质层蜡质结构不同。如果这种差异，也存在于无菌和非无菌生长的莴苣幼苗，生长调节剂渗入外植体不同，可能说明愈伤组织形成的不同模式。
(6)基因型 表21-5指出莴苣基因型的影响。Doerschug等(1967)报道了八种供试栽培品种都能再生。Alconcero(1983)研究Lactuca二种野生种和L．sativa，L．serriola ACC500#3种栽培品种，当将悬浮培养体植板在固化培养基上时，生芽最多。L．saligna叶产生愈伤组织慢，植板培养生芽最少。
总之，全部基因型和大多外植体源能取得再生植株，采用适当水平生长调节剂的话。莴苣对外源生长调节剂反应与其它植物种的相似。愈伤组织形成需生长素和细胞分裂素二者。芽再生则以细胞分裂素加少量或不加生长素为好。对先反应资料不一致。表3指出取得大量再生植株的重要条件。子叶比从成株的外植体易于培养。采用启动和转移培养基二步法可能增多再生株数，但用单一培养基经常可取得芽。
3．原生质体培养和再生 Binding等(1981)比较77双子叶种在标准试验条件下再生能力。莴苣原生质体分裂和形成10个以上细胞团，但未见进一步生长。Engler等(1982)从几种不同基因型叶原生质体再生植株成功。Berry等(1982)只有一个栽培品种，检测几种不同植株部位作原生质体源，和比较几种培养基效率。
(1)外植体源 Berry等(1982)发现2日龄无菌生长子叶的原生质体植板效率最高。根和人工培养生长的叶取得满意效果。温室或生长箱生长植株的叶原生质体产量低，植板效率低。Engler等(1982)用新充分扩展叶取得高产和植板效率高的原生质体。最幼叶比老叶产量较高，但植板效率较低。大田或温室生长植株的叶原生质体不分裂，而同株上茎尖确能增殖。无菌生长植株茎尖与叶原生质体植板效率最高。幼年组织比分化的叶肉作为原生所体源的优越性，由于诱导有丝分裂较多，次生代谢产物水平较低，幼年组织培养原生质体所需代谢途径转变较少。后者似对供体植株年龄和生长条件敏感性较低。
证实了基因型差异。cv．Climax比crisphead cv。取得的原生质体较适于用Engler等(1982)培养程序。但全部cv．均能不同程度地再生。
(2)预处理 Engler等(1982)分离原生质体前用低光强培养植株4-10天。降低了淀粉颗粒数，后者在离心时会使细胞膜破裂。Berry等(1982)未用低光预处理，这可能部分说明从叶分离原生质体未得成功。幼年组织可能无有大淀粉颗粒。除去下表皮培养在MS加NAA和BA预处理温室生长的叶，导致较低原生质体较低，但植板效率增高。这种培养基诱导了愈伤组织发育，由此可能从脱分化而不是分化细胞产生有生活力原生质体。
(3)培养基 Berry等(1982)发现Kp用于无菌生长材料最有效。Kp是一种复杂培养基用于大豆原生质体培养，含有细胞壁多糖前导物，TCA循环中间产物，维生素，酪蛋白氨基酸和CW以及大和微量元素。Engler等(1982)用与MS相似的简单培养基，加甘氨酸和琥珀酸钠，指出Kp不是绝对必要的。同样MSp2(Berrg等1982所用)效果比Sp稍低。Engler等发现启动培养基必需不加NH4+，而为了芽再生这是必需的。Binding等(1981)所用V-47培养基也比Kp为简单(相对地)。
莴苣培养体倾向于转黄停止生长，尤以遇逆境时为甚。Berry等(1982)用新鲜培养基有规律地稀释培养体，或把细胞培养在滤纸上，以防止其发生。Engler等(1982)注意到培养基pH很快降低，对生长不利，可能促进坏死。用琥珀酸钠缓冲液(5mM)，调整启动pH为6．0，和低密度植板，和减缓pH下降。Berry等(1982)连续加新鲜培养基，有减小pH变化的倾向。他仔细地逐步降低培养基渗透性和生长素水平，这在一步中完成。
(4)植板密度 大多数植物种原生质体采用高密度植板，再生较高。设想这是由于使溶质漏出的不良效应减到最小的结果。Berry等(1982)采用薄层琼脂(4ml琼脂+4ml原生质悬浮液，装在5cm培养皿内)克服这种漏出效应。Engler等(1982)乐于采用低密度(8000原生质体／板)，植板效率虽低(2．5%)，但芽再生率较高密度植板的为高。
总之，二步培养法间有相当大差异，虽功能取得原生质体再生。由于Berry等(1982)并未报道再生率和再生速率，不能比较其相对效率。现需研究整合这二种程序，使原生质体再生率达到最适程度。Engler等(1982)法已取得重复成功(Lanelry等未发表)，但植板效率高度不稳定。供体植株年龄和适合度似是关键。幼龄组织和无菌生长植株超过温室生长或生长箱植株作为原生质体源的优越性，与那些植株外植体再生率相平行。NH4+水平与外植体源一样，是愈伤组织生长和分化的关键。
4．培养后变异 再生芽表现出广泛形态变异。有时产生小叶而无芽发育。叶形态变异明显。常见失绿和玻璃苗，很少生根。有时呈扁化芽。产生启动芽后，常见次生芽滋生。Sibi(1976)注意到最初产生的芽，比后期发育的，有表现更反常趋向。作者诱导雄核发育时，计数了莴苣头状花序产生愈伤组织的染色体数。观察到18-36，指出愈伤组织来源于二倍体，和培养程序的诱变性质。
再生植株(P0世代)常出现叶形、大小，节间长变异，但经转移到温室或大田，有趋于消失之势。当保持在18℃以上时，许多再生株很快抽薹和开花。Sibi(1976)取得的再生株全是二倍体。Engler(1983)以原生质体再生的许多植株高水平不育。这些植株与对照比较，常有正常花数和表征，并能产生花粉。有的产生少数大种子，是四倍体。其它不育植株是二倍体。用同批种子产生的P0植株与未培养对照相比种子重也有显着差异。种子重、种了数、P0形态或生产种子时期间无相关。但是种子重和未再生植株数受植株生理状态影响。
P1世代观察到质的和量的变异。Engler等观察到叶绿素缺失变异体，在P1世代呈3野生型比1变异体，指出P0植株具有一个隐性突变。Engler(1983)报道8种变异包括生长率，子叶形和色也同样分离为3∶1。有的变异似乎是质的，P0不分离。Sibi观察到叶形、叶绿素缺失和黄绿苗等三种变异体，P1都是同质的，但与对照有显着差异。Engler取得二种幼苗生率变异体也不分离；植株生长一致较慢。8天后大小差别消失，2-3周后，不再可分辨。P1叶形趋于形成腋芽和头状花序重和大小。比对照更为可变。每个P1家系的平均头状花序重比对照为轻。自交三代(P2，P3和P4)后，研究三种不分离质变异体的行为。叶形变异体稳定的，而叶绿素缺失变异变得逐渐难以辨认。三种变异体和一个对照植株的P3植株进行了双列分析。叶形变异以母性传递为主，指出是细胞质决定的，虽然其表达强度视父本有异。Sibi观察到的形态变异母性遗传，提出是核外突变。突变的细胞器表现这类表型一致性和稳定性，将有利于选择。
Engler(1983)仔细记载再生植株谱系。没有一块愈伤组织产生二倍体或四倍体混合的再生植株。一块愈伤组织产生四个四倍体再生株。由此多倍体似乎是第一次有丝分裂时的不离开，或分离时原生质体融合的结果。反之，愈伤组织阶段可能发生核突变，结果产生异质的P0植株。大多数P1世代分离的克隆，具有从同块愈伤组织产生的姊妹克隆，这种愈伤组织并不出现突变。只有一例，从同块愈伤组织产生的二个克隆，确实带有相同表型的突变体等位基因。
5．离体培养选择 Engler(1983)用乙烯或缺钙培养基选择原生质体再生株的朽叶斑病和顶枯病抗性。朽叶斑病是收获后问题，当把莴苣头状花序暴露在0．1-10ppm乙烯中时，不可预见地出现。顶枯病是很快扩展内部头状花序叶缺钙时发生。虽有遗传差异，但用常规育种方法未能发现其高水平抗性。
在原生质体在A／B培养基再生期间，用0．1-700ppm乙烯处理，对植板效率或愈伤组织生长率无影响。由此用乙烯处理人工培养下诱导抗性似不可行。这些结果与用低浓度乙烯处理莴苣髓外植体的资料相反，0．1ppm乙烯抑制愈伤组织发育和管胞分化。
为了试图选择顶枯病，cv．Climax原生质体植板在A／B培养基上。钙作为各组分的杂质加入，使培养基达到近于2%正常钙浓度(3mM)。选择压为5．5×10-4。有些原生愈伤组织在低钙培养基的生长率与完全培养基上的相似。当转入完全DM培养基时，17%生芽。从其再生植株10株取得原生质体，有二株的在缺钙培养基上再生增高。可惜，未见报道用对照处理测验这种结果是否反映出在低钙下耐性增强或增高再生能力。从3株低钙再生株(包括再生率高的2株)的子代生长在洗过的沙中，用缺钙营养液浇灌。以感顶枯病cv．Climax和部分抗性的cv．Salinax为未培养对照。12天内，只有cv．Salinax幼苗未出现严重顶枯病病征。所以在低钙培养基上选择无效。取2株P0再生株，表现出在低钙培养基上原生质体再生增高，让其自交。每再生株取7P1植株的原生质体，当培养在低钙下，植板效率相同。可见这种变异和后生的而不是遗传的。
6．营养繁殖 关于莴苣茎尖分生组织不经形成愈伤组织进行营养繁殖试图达到克隆间变异最低的报道极少。这种技术能用于从成熟头状花序(大田切取后选择的)取得繁殖系。Koevarg等(1978)用Miller加IAA(28．5μM)和KIN(2．3μM)培养品种Calmar成熟头状花序的扩展的芽或6个段，培养体放在25℃，800lx每天16h。未扩展芽无反应。在同样条件下，叶外植体在芽和根形成前，愈伤组织滋生。芽在Miller加IBA(0．49或4．9μM)上生根。
Dore等(1984)能保持雄性不育系营养体。未成熟头状花序(长3mm)是开花植物能回复营养生长的唯一外植体源。ADE是刺激花顶尖营养的分化组织活动最有效的培养基，而愈伤组织极少形成，培养条件是23℃日，2000lx，18℃夜。再生植株有很快开花趋向，可用降低培养温度(18℃日，12℃夜)或增高蔗糖浓度(到0．5M)予以克服。BA增加出芽量，而无愈伤组织形成。从营养顶尖解剖取得个体再生株，培养在无生长调节剂的培养基生根。
(二)展望
诱导培养体(体细胞克隆变异)，原生质体融合，基因转移技术产生的变异，都能增加莴苣变异。人工培养选择和花药培养为变异的更有效操作提供潜势。组织培养和其它技术虽能有助于增加变异或组合变异，但必需与经典育种策略相整合，才能有效。
1．体细胞克隆变异和离体培养选择 从莴苣叶外植体(Sibi 1976)和原生质体(Engler1983)再生植株观察到广泛变异。由于莴苣特具的园艺要求，难于取得优越(与品种相比)的园艺特性，迄今似若如此。与多倍体种不同，从筛选再生植株的随机发生、体细胞克隆变异，无此便利，以及莴苣的许多特性经控制杂交后，筛选有性后代以诱发存在的变异。即使能鉴定出有用体细胞克隆变异，在应用商品生产前，需经杂交和选择。
离体培养选择利在能筛选大量细胞，目前尚不清楚莴苣的限制因子可供培养下选择。如果能在细胞水平上鉴别耐盐或抗顶枯病或朽叶斑病生理基础，离体培养选择可能是有效的。Yoder(1983)指出若干莴苣病害有毒素，特证实后，离体选择抗性才能有效地进行。已知草酸是Sclerotinia spp．的致病因素，离体培养选择草酸耐性有困难，由于草酸钙在培养基中沉淀，并于选择耐低钙增加了复杂性。还不能可靠地使病毒100%感染原生质体，人工培养下选择病毒抗性不现实。莴苣生产常用除莠剂，目前其抗性似可提供在人工培养下选择的最大潜力。
2．花药培养 莴苣花药培养由于头状花序内(长4mm)有18小花，花药长仅0．5mm以下。且在有生长素时易于产生二倍体愈伤组织，而这是切取花序时不可避免的。花药中花粉少(约200个)。迄今尚未鉴别出基因型、预处理、植板程序或诱导雄核发育的培养基。曾培养过完整头状花序和花药。
3．原生质体融合 仅在不亲和种内存在Sclerotinia spp．和巨脉抗性。采用原生质体融合可能进行异种基因转移。莴苣尚未可供选择的标记基因，原生质体需经愈伤组织、细胞悬浮体或一个种的根制取，由可以鉴别，相互分离，和培养杂核体。莴苣与L．perennis原生质体融合已用于把粉霉病抗性引入莴苣。莴苣的所有抗性主基因是短命的，病原菌Bremia lactucae是高度可变的，也无论据说明L．perennis抗性是稳定的。
4．基因转移 不久可望采用Ti质粒转移外源基因成为常规技术。浓杆菌与外植体共培养产生了转化愈伤组织。细菌与外植体共培养达到转化，将成莴苣改良中组织培养最适用方式。DNA微注射原生质体，待改进植板效率和再生率后，是有价值的。由于莴苣花粉是三细胞的和短命的，用花粉微注射法有问题。因此，Ti质粒载体转化，可能是目前最有效方法。除莠剂抗性和抗虫性可能是有价值引入的。引入可选择标记如卡那霉素和氯霉素抗性可供原生质体融合后进行有效选择杂核体之用。
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