番木瓜
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第590页（9940字）
番木瓜(Carica papaya L．)属番木瓜科(Caricaceae)。番木瓜属(Carica)共有22种，2n=18。番木瓜是C．peltafa与野生种自然杂交产生的。番木瓜种广泛栽培，高产，不仅用作果食，也有生物化学剂之源。是原维生素A和抗坏血酸的好给源。
(一)研究进展
1．愈伤组织诱导 不同类型番木瓜外植体产生了愈伤组织，如幼苗叶柄，幼苗茎切断，子叶和胚珠。Litz等(1980)报道C．stipulata花梗切段诱导产生愈伤组织。大多数学者采用MS也有用WH的。Medora等(1979)诱导幼苗茎段愈伤组织和生长的最适生长调节剂是1．8μM 2，4-D。也证实了NH4NO3对愈伤组织生长有重要性，提出BA有抑制作用。另一方面DeBruijne等(1974)，Arora等(1978)，和Yie等(1977)肯定了NAA有利愈伤组织生长。Arora等(1978)肯定了IAA和2，4-D抑制愈伤组织形成。再者，Arora等(1978)和Yie等(1977)在其培养基中加KIN0．5-2．2μM。DeBruijne等(1974)用培养基加10μM2iP取得最高愈伤组织产量。C．stipulata花梗外植体培养在2．2μM BA和0．54μM NAA取得优质愈伤组织培养体。显然NAA加KIN，2iP或BA是番瓜愈伤组织诱导和生长最适条件。
番瓜愈伤组织淡棕色或白色，海绵状结构。接种后6-7天可见愈伤组织，生长相对旺盛。Litz等(1983)番木瓜子叶培养在含有不同组合的NAA和BA培养基上，区分出三种不同愈伤组织诱导反应。中脉和脉组织诱导最适条件是1．3-8．8μM BA和2．7-16．2μM NAA，而叶身则需要6．5-27．0μM NAA和2．6-73．2BA。在低浓度0-1．1NAA和中等浓度0．2-4．4μMBA上二者产生硬、深绿色愈伤组织。诱导愈伤组织对生长调节剂要求视外植体源或性质而不同(表23-5)。
表23-5 不同外植体类型的愈伤组织诱导和生长所需生长调节剂比较
2．体细胞胚胎发生 DeBruijne等(1974)用三步程序培养番木瓜幼苗叶柄切段产生的愈伤组织诱导体细胞胚。先将外植体暗培在MS加1．0μM NAA和10．0μM 2iP。建立了胚胎发生感受性，转入光暗，愈伤组织继代在WH加0．01μM BA，0．1／μM NAA和29．0mM蔗糖，或WH不加维生素，但加0．001μM ZEA，0．01μM BA和0．58M蔗糖培养基上，再生球形胚。再转入
不加维生素但加0．01μM BA和0．10mM NAA发育成熟胚。提出胚胎发生似乎有赖于低蔗糖浓度(29．0mM)。Litz等(1981)虽证实了WH加更高蔗糖(175mM)和20%CW高频率再生体细胞胚。
Yie等(1977)采用二步程序诱导幼苗茎愈伤组织体细胞胚胎发生。在MS加5．4μM NAA和0．5μMKIN诱导产生愈伤组织后，转入第二培养基含0．3μM IAA和4．7-9．4μM KIN再生体细胞胚。
Litz等(1981)报道培养番木瓜胚珠诱导多胚性，和控制胚珠愈伤组织的体细胞胚胎发生。WH加不同生长调节剂成分：不加生长调节剂，0．4，0．9，2．2和4．4μM BA；和CW20%诱导胚珠愈伤组织的胚胎发生感受性。继代在固体或液体WH加175mM蔗糖和2．7mM谷酰胺，结果产生很高频率的体细胞胚胎发生。液培效果更突出。转入固体WH加87．6mM蔗糖，2．7mM谷酰胺，0．5-10．8μM NAA和0．2-0．9μM BA诱导成熟胚发芽，并进行液培WH加175mM蔗糖，2．7mM谷酰胺和5%CW取得体细胞Carica胚的未熟发芽。
C．slipulata花梗外植体培养在液体MS产生的悬浮培养体，观察到体细胞胚胎发生，但只有在转入2．2μM BA，0．5μM NAA和10g／l活性炭后才有发生。这种程度尚未试图应用于番木瓜愈伤组织培养体。
3．器官发生 Yie等(1977)不仅从番木瓜茎愈伤组织诱导产生体细胞胚，但在相同培养基上也观察到不定芽(MS加0．3μM IAA和4．7μM KIN或单用9．4μM KIN)。Arora等(1978)发现必须将诱导培养基(LS加10．8μM NAA，2．3μM KIN，0．74mM硫酸腺嘌呤和其它附加物)的愈伤组织μM KIN和1．1μM NAA的愈伤组织转入芽诱导培养基(LS加9．2μM KIN和1．1μM NAA，而0．9μMKIN和2．7μM KIN诱导生根。
Litz等(1983)证实了番木瓜子叶培养在MS加0．5-81．0μM NAA和0-2．2μM BA，从其中脉愈伤组织形成不定芽。从培养在含0-1．1μM NAA和0．2-4．4μM BA培养基上叶身和中脉愈伤组织形成不定分生组织。
4．茎尖培养 Mehdi等(1976)在MS加4．7μM KIN的番木瓜幼苗茎尖建立了培养体，移至4．7μM KIN和24．5μM IBA诱导生根。未见多芽形成。Yie等(1977)建立离体培养番木瓜幼苗茎尖增殖生长。
Litz等(1977，1978)提出大田成年番瓜茎尖培养程序，取2-3mm茎尖培养在MS加87．6mM蔗糖147μM KIN，和10．8μM NAA培养基上。2-3个月后，取胀大的外植体继代在芽增殖培养基上：MS加2．2μM BA和0．54μM NAA。培养体建成时间和增殖率视母株年龄、年内季节、性类型和是否有细菌和病毒(rhabdovirus)污染而异。雄株的反应比雌株快，增殖较甚。在母株很快生长期间取的外植体反应最好。克隆间增殖速度不同，一般继代间增殖7-8倍。维持增殖培养体能力，经8-13次继代后消化。将侧芽继代在MS加5．4-16μMNAA，87．6mM蔗糖诱导产生顶端优势和生根。再生植株移栽大田成功。
5．胚培养 Phadnis等(1970)培养成熟番木瓜胚在WH加0．24μM KIN单用，或0．24μM KIN，0．3μM GA和0．6μM IAA取得成功。DeBruijne等(1974)用MS不加肌醇，CH或维生素，加58．4mM蔗糖也显然成功。Khuspe等(1980)证实了采用胚培养拯救C．papaya×C．cauliflora未成熟胚的实用性。用固体WH不加维生素，但加58．4mM蔗糖12．0μM氯化铜和1．2μM钼酸钠，暗培使离体未成熟杂种胚发芽。继之，幼再生植株继代在液体WH加维生素和甘氨酸，生长到可移栽大小。这为把C．cauliflora的环斑病毒抗性用于有性不亲和番瓜种的改良创造了前提。
6．花药培养 Litz等(1978)报道了番木瓜花药培养产生单倍体植株。遮荫室生长植株上取聚伞雄花序，按花芽大小分类，一般7-8mm花芽的花药处于四分子形成期；16-20mm第一次有丝分裂。取反映各个发育时期的花芽，经4℃预培养3-4天后，接种在MS上。以16-20mm花芽的花药液培在MS加87．6mM蔗糖，8．8μM BA，2．7μM NAA，和10g／l活性炭，效果最好。约每1000培养的花药产生再生植株1株。再生株单倍体染色体为n=90。
7．原生质体分离和培养 Litz等(1979)虽已报道大规模分离番木瓜原生质体，培养程序中最适条件和分离步骤都已有改进。详见原生质体分离和培养原生克隆节。已取得有限的愈伤组织诱导发生和低植板效率(Litz等，未发表)。
(二)培养程序
1．器官发生(Yiu等，1977；Arora等，1978)
(1)发芽和生长6-12番木瓜幼苗于泥炭∶珍珠岩(1∶1)中。用0．5-1．0cm叶柄或茎切段为外植体。5%clorox(v／v)溶于蒸馏水加1-2滴吞温20表面消毒10min。无菌蒸馏水充分淋洗3次。无菌培养于营养液加3-5%蔗糖2-3天。除去污染培养物。
(2)外植体转入固体WH，LS或MS附加：5-6μM NAA和0．4-0．5μM KIN(Yiu等1977)，或10-11μM NAA，2．0-3．0μM KIN和3．0μM GA，13．3μM甘氨酸，1．0g／lCH，500mg／l ME，740μM硫酸腺嘌呤，0．04M烟酸，3．0μM盐酸硫胺素和4．9μM盐酸毗哆醇。全加0．087M蔗糖和8 g／l琼脂。用0．1NHCl或NaOH调节pH到5．7。高压蒸气消毒1．1kg／cm2，120℃15min。培养物放入生长箱内，25℃，光周期16h，光强1000lx。
(3)每隔2-4周继代一次，用相同培养基。
(4)愈伤组织转入无菌培养基加∶0．3μM IAA和5-10μM KIN，或1．0μM NAA和10μM KIN，以诱导芽分化。
(5)取不定芽转入无细胞分裂素培养基重建顶端优势。在培养基加5-15μMNAA或IBA可同时诱导生根。
(6)把带根再生植株移入无土钵混合物，在保护区段内间歇喷雾，约2周。
2．茎尖培养(Litz和Conover，1978)
(1)从成年大田生长番木瓜植株取2-3cm茎尖。一般番瓜无分枝，但摘顶后，能诱导产生6个侧茎。茎尖3-5cm时，除去大叶柄和花序。
(2)5-10%clorox(v／v)溶于蒸馏水加1-2滴吞温20表面消毒茎尖约10min。无菌蒸馏水充分淋洗3次。无菌培养在营养液加87．6-146mM蔗糖2-3天。除去污染培养物。
(3)用清洁茎尖转入固体MS，WH或LS加：50μM KIN和11μM NAA，87．8mM蔗糖和8g／l琼脂。用0．1N HCl或NaOH调节pH到5．7，高压蒸气消毒1．1kg／cm2，120℃，15min。
(4)培养物放入生长箱，25℃，光周期16h，强光10001x。
(5)培养1
月后，茎尖长大，但顶端优势受抑制。用长大茎尖转入增殖培养基：MS加2．2μM BA，0．5μM NAA，87．6mM蔗糖，8g／l琼脂。
(6)增殖培养基上2周后，诱导产生侧芽生长。切取侧芽继代，每隔3周转入新鲜增殖培养基。
(7)侧芽继代在MS加5-15μM NAA或BA以重建顶端优势和形成再生植株。同样培养基取得生根。
(8)除去再生植株根部琼脂，移栽无土混合钵土内，在保护区段内间歇喷雾2周。
3．番木瓜胚珠愈伤组织有效的体细胞胚胎发生(Litz等，1982)
(1)已有可能未受精番木瓜胚珠诱导胚性发生，和从番瓜杂交胚珠内产生低频率胚性发生。为了取得最好结果，用C．cauliflora花粉授粉带有圆筒形果实的番瓜雌蕊，套袋30一120天，直到收获。
(2)将果实浸入20%(v／v)clorox表面消毒20min。无菌蒸馏水充分淋洗。
(3)解剖果实取出胚珠。放在无菌固体培养基100×15mm培养皿。培养基用1／2MS大元素和Fe·EDTA，MS微量元素和有机成分，2．7mM谷酰胺，175mM蔗糖，20%(v／v)过滤消毒的CW，高压蒸气消毒前用0．1N HCl或NaOH调节pH到5．7。高压蒸气消毒用1．1kg／cm2120℃15min。
(4)培养体放在生长箱25℃，光周期16h，光强10001x，最幼胚珠1．5月到最老胚珠3月。
(5)培养1．5月后，最幼胚珠破裂和放出体细胞胚和愈伤组织。最老胚珠必须解剖取出。
(6)从胚珠除去愈伤组织。愈伤组织硬和蜜色。用上法把愈伤组织继代在新鲜无菌培养基上。取得有限的体细胞胚胎发生。
(7)经1-2月后，愈伤组织继代在固体或液体培养基不加20%CW。液体培养物放在旋转振荡器上100rpm。产生体细胞胚胎发生。由此有可能取得充分成熟胚。
4．原生质体分离和培养
(1)番木瓜种子放在无土钵混合物中，在生长箱内25℃光周期16h。有规律地浇水和施肥。促使发芽。
(2)发芽后4-8天取子叶，漂浮在溶液上：1．0mM NH4NO3和1．0mM CaCl，·2H2O，22μ．M BA，5．4μM NAA，暗培1．5-2．5天。
(3)5%(v／v)Clorox加1-2滴吞温20消毒5min后，除去中脉，叶身撕成1mm条，浸入
加3．0mM CaCl2·2 H2O，0．3M甘露糖醇和500mg／l酪蛋白，在柔和光线下约1h。
(4)用过滤消毒的酶混合液代替浸液。酶混合液组成：
加3mM CaCl2·2H2O，500mg／l酪蛋白，200mg／l Garramycin，22．5mM四环素，1．1mM阿比西林，0．3M甘露糖醇，0．5%macerozyme和1．5%纤维素酶。叶组织用酶混合液真空渗入处理，暗培，旋转振荡器40rpm4h。
(5)原生质体悬浮液经63μM筛过滤，70-80×g离心5min，分离原生质体。除去上清液，换之以相同溶液，重复2-3次。
(6)原生质体再悬浮在培养基中，
大量元素不加NH4NO3，加3mMCaCl2·2H2O．500mg／l酪蛋白，0．3M甘露糖醇，MS微量元素，
Fe·EDTA，MS有机成分，2．7mM谷酰胺，10%CW，58．4mM蔗糖和5mM NH4NO3，密度1-2×105原生质体／ml，用密度5×104-1×105原生质体／ml植板在薄层液基中(装在培养皿内)。
(三)展望
有些番木瓜属野生种具有有用特性，如抗病性、耐寒性、小果实、和生长习性矮，是改进番木瓜所需的。许多种和番木瓜的不亲和性性质尚不清楚，但应用胚或胚珠培养、人工受精、甚至控制下原生质体融合，应有可能予以克服。
能有效地再生体细胞胚或不定再生植株的悬浮培养物，将成为番木瓜开发离体培养选择体系最重要手段。番木瓜植株对杀虫剂和除莠剂损害极度敏感，对许多真菌病原菌例如Phytophthora sp．，Pythium sp。等等毫无抵抗能力。离体培养选择化学损害抗性和毒素抗性，将能大大地降低生产损失。
Medora等(1973)报道蛋白水解酶活性在幼苗茎愈伤组织培养物产生，表征了有些酶的基质专化性(Mellet等1979)。番木瓜果实愈伤组织未见这种活性，但在番木瓜成熟果实中很少papain。papain是硫氢基酶，和硫氢基是酶活性所必需。在酶制品中加半胱氨酸可克服硫氢基的破坏。在细胞培养体中加番木瓜酶的适宜前导物有可能产生番木瓜酶。另一方法，加半胱氨酸使硫氢基不受破坏，由此有可能在离体培养下活化已存在的蛋白水解酶。
经组织培养克隆产生的体细胞变异植株，可用于克服作物为害状态，包括番木瓜栽培品种。番木瓜属体细胞胚产生的再生植株出现一些有价值变异性，包括高比例的3或4子叶、叶柄色素差异和节间长度变化。也曾观察到培养的茎尖产生低比例的两性花植株转变成雌性类型。无论从叶原生质体经器官发生，或从增殖中的茎尖培养物，或从体细胞胚产生的番木瓜植株，可能具有满意有用变异，供番木瓜改良利用。
渴望花药培养产生有效单倍体植株产量的程序。大田条件抗病和逆境的单倍体植株，经染色体加倍可产生同质二倍体母系。用同质雄株产生杂种栽培品种，将消除雌雄异株番木瓜类型间的变异性。
研究番木瓜原生质体再生植株的完整程序，将有助于植物育种家，如遗传工程技术，好比重组DNA或细胞器吸取，变成直接应用于番木瓜改良。
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