薄层色谱扫描法
出处:按学科分类—医药、卫生 中国医药科技出版社《中药辞海第三卷》第1560页(1311字)
薄层色谱扫描法薄层色谱色斑的测定用薄层色谱扫描仪,是用一定波长,一定强度的光束直接照射在薄层色斑上,根据光强度的变化,从而进行定性和定量测定。
双波长测定法是利用两束不同波长的单色元λs和λR交替照射在色斑上,测定其吸收值差△A。
∵A=KC 而选择λR对色斑无吸收或吸收小
∴AλR=0
△A=Aλs-AλR
∴△A=Aλs
吸收值差与被测样品量成正比关系。由于色斑对光有了吸收,在记录纸上呈现出一个峰,根据峰面积大小,即可计算出色斑中化合物的量。在仪器上,经过自动计算,显示出积分值。
测量方法有3种:
①透射法 单色光垂直照射在薄层表面,并透过色斑,测量透射光的强度,以测定斑点内被测物质的量。
②反射法 单色光垂直照射薄层色斑后,测量其反射光的强度,以测定色斑内物质的量。
③荧光法
(1)直接测定法 在紫外光照射下色斑产生荧光,直接测量色斑所发生荧光的强弱而定量。空白的薄层部位必须设有荧光产生。
(2)荧光减退法(荧光熄灭法) 在薄层固定相中加入适当的荧光物质,在紫外光照射下薄层产生荧光,而色斑所在位置由于化合物吸收了紫外光,薄层上荧光物质所接收的紫外光量减少,故荧光强度减弱,即在荧光背底上出现暗斑。荧光也按比例减弱。
扫描形式
①线性扫描 用和色斑直径等长的狭缝状光束单向扫描,称为线性扫描。
②锯齿形扫描 用一个正方形光束(1.25mm×1.25mm或更小)照射色斑,或锯齿状扫描,称锯齿形扫描。
例如金银花中异绿原酸和绿原酸的薄层扫描测定,将金银花的甲醇提取液和异绿原酸、绿原酸对照品,分别点在硅胶薄层板上,用醋酸丁酯-甲酸-水(7:2.5:2.5)为展开剂展开后,用薄层扫描仪扫描·
扫描条件:
波长 λs334mm λR400mm
扫描方式 锯齿形扫描
浓度与积分值的关系:异绿原酸的量在3μg内,绿原酸的量在4μg之内,浓度与积分值成线性关系。用比较法分别求出绿原酸与异绿原酸的含量。