荧光分光光度法

出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第422页（3183字）

荧光分析法具有灵敏度高，选择性强，用样量少和方法简便等优点，不但是基础理论研究的有效工具，而且在工、农、医、环保、化工、冶金、地质等领域也是重要的分析方法之一。

当用一种波长的光照射某种物质时，这个物质会在极短的时间内发射出较照射波长为长的光，这种光称为荧光。早在16世纪，人们就注意到植物抽提液和矿物的荧光发射。1852年，斯托克斯(Stockes)阐明了荧光发射的机制。

荧光的产生是由于某些物质分子吸收电磁波能量，由基态跃迁到较高的能级(激发态)后，首先通过内转换过程损耗一部分能量，回到第1电子激发态的最低振动能级，同时以光量子的形式发射能量，即为荧光。荧光发射的量子能量小于入射光量子能量，所以荧光波长大于激发波长。产生荧光的过程很快，约在10^－8s内完成。一旦除去激发光(入射光)，荧光也随之消失。

荧光分析能提供较多的参数，从各个角度反映分子的发光特性。

通过对这些参数的分析，不但可以做一般的定量测定，而且还可以推断分子在各种环境中的构象变化，从而了解大分子的结构与功能关系，这些参数包括：

1．激发光谱和发射光谱。这是荧光光谱的两个最基本的参数。

激发光谱是引起荧光的激发辐射在不同波长的相对效率。发射光谱即是分子吸收光能量后再发射的结果。

根据激发光谱和发射光谱的形状和强度可对物质进行定性和定量分析。如欲得到物质的真实荧光光谱(又称校正荧光光谱)，必须设法消除仪器中光源、单色器、检测器等光学元件的光谱特性对物质的荧光光谱的影响。

2．斯托克斯(Stockes)位移。

单位是cm^－1，λ_ex和λ_em分别是校正后的最大发波长和最大激发射波长，单位是nm。

3．荧光强度和总荧光量。荧光强度用来表示荧光的相对强弱，所用的是任意单位，测定一个物质的相对荧光强度F与很多因素有关：F=KφI_o(1－e^εbc)=KφI_o(1－e^－A)这里K是仪器常数，φ是量子产率，I_o是激发光强度，ε是摩尔吸光系数，b是样品池的光径，C是样品的浓度，A是样品的吸光度。

当A很小时，F=KφI_oA。当A增加至一定值时，F不但不随A的增加而增加，甚至随A增加而减少，这就是所谓的浓度淬灭现象。

总荧光量即发射光谱的面积。

4．量子产率。

表示物质发射荧光的本领，用φ表示。其定义为发射量子数与吸收量子数之比。

浓度、温度、溶剂、激发波长和荧光标准的选择都会影响量子产率测定的准确性。1924年，惠维罗(Wawillow)首先进行量子产率的测定。20世纪50年代前后大多用绝对法来测定，方法繁琐，容易引入误差。

现在大多用派克(Parker，1960)和陈(R．F．chen 1965)提出的相对法。

5．荧光偏振。如果将一个荧光物质放在荧光仪的起偏器和检偏器之间，就能测出它旋转电矢量的能力。由此可以计算分子的形状、大小、运动状态等。荧光偏振用P表示，F₁₁是起偏器和检偏器的矢量方向互相平行时测出的荧光强度，F_⊥是它们的电矢量方向互相垂直时测出的荧光强度，G为校正因子，是水平偏振光对垂直偏振光的透射效率之比。

6．荧光寿命。当去掉激发光后，分子的荧光强度(I_t)降到激发时最大荧光强度I_o的1／e所需要的时间(t)，称为荧光寿命，常用τ表示。

I_t=I_oe^－t／τ荧光分析仪器大致包括荧光分析灯、滤片荧光计和荧光分光光度计三大类。它们通常由光源、激发单色器、样品室、发射单色器、检测器、放大器和记录显示装置组成。

(1)光源：荧光分析灯和滤片荧光计的光源通常采用汞灯或氘灯和钨灯。但荧光分光光度计的光源通常用氙灯，它发射从紫外到近红外的连续光谱。(2)单色器：荧光分析灯和滤片荧光计采用滤片作为单色元件，因而只能得到发射光谱的总荧光量，不能扫描荧光光谱。

荧光分光光度计大多采用光栅作为分光元件。

单色器的单色性影响光谱分辨率。(3)样品室：样品室中安放各种荧光池。

由样品发射的荧光通常在与入射的激发光成直角方向被检测。(4)检测器：简单的荧光分析器常用光电管作检测器。

荧光分光光度计则用光电倍增管作检测器，它把微弱的荧光信号转换成电信号且放大数十万乃至数百万倍，以供定性定量测定。(5)放大及记录显示：把光电倍增管输出的电信号送到前置放大器和主放大器放大，最后用表头、记录仪或屏幕显示其光谱或数据。

荧光分析的灵敏度很高，它比吸收光谱法灵敏度高2到3个数量级，能检测10^－12g的物质。利用荧光物质本身的荧光可以直接进行检测，称为直接测定法或内源荧光法。

有些物质本身不发荧光或量子产率低，不易测定。这时可以利用外源荧光法(也称荧光探针法、间接测定法)进行测量，这是利用某些荧光探剂使其与荧光较弱的或不显荧光的物质共价或非共价结合，以形成发荧光的络合物再进行测定。大部分生物物质荧光量子产率很低(如蛋白质、酶)或不发荧光(核酸)，所以利用外源荧光法才可灵敏地进行定性和定量分析。此外，利用外源荧光法还可以研究大分子的溶液构象。

如为了研究药物与受体、抗体与抗原、酶与辅基等重要生物活性物质的结合状态，可测定结合时小分子或大分子的荧光参数的变化。根据荧光探剂和大分子或膜结合时的荧光变化，可以探测大分子或膜的构象，也可以了解微环境的疏水性、微粘度、化学基团之间的距离、变构效应、二级结构变化、测定二硫键等。

因此，荧光分光光度法在分子生物学研究中得到广泛的应用。

由于荧光分析灵敏度很高，因此对血液、尿和组织的取样量很少。

例如用一滴血就能测定血液中葡萄糖的含量。用荧光法进行酶的定量分析，灵敏高也很高。如采用荧光法代替比色法化验肝功能的转氨酶，抽血量可减为1／1000。甾族化合物用荧光测定的灵敏度很高，如雌酮能测到1×10^－11g，孕甾酮能测到1×10^－10g。

许多药物能用荧光法进行分析和鉴别，如有些药物注射剂量很小，有时低到100μg／L水平，用荧光法能化验出它自体内的排泄量，例如阿斯匹林可测到10^－10g，青霉素可测到5×10^－8g，链霉素可测到1×10^－9g。

在环境保护和卫生防疫工作中，荧光法也得到广泛的应用，可用测定空气、水源和食物的污染，其中有些是致癌物质，例如存在于废气、香烟烟雾、某些水源和食物中的3，4－苯并芘是一种强致癌物质，用荧光法测定灵敏而可靠。又如发霉的花生和烟叶中的黄曲霉素也可用荧光测定。污水中一些有害的重金属离子，也可通过间接方法测定其含量。

如铅可测到5×10^－8g，汞可测到1×10^－9g。

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【参考文献】：

1 陈国珍．荧光分析法，北京：科学出版社，1975

2 郭尧君．荧光实验技术及其在分子生物学中的应用，北京：科学出版社，1979

3 Wehry E L．Modern Fluorescence Spectroscopy，Plenum Press，New York，1981，1～4

4 陈国珍，等．荧光分析法．北京：科学出版社，1991

(中国科学院生物物理所郭尧君研究员撰)